Automated, compliance-ready, intact mass confirmation of modified oligonucleotides using an LC-MS platform

Význam tématu

U analýzy terapeutických oligonukleotidů je potvrzení identity a čistoty klíčové pro vývoj a výrobu. Intaktní hmotnostní analýza kombinující kapalinovou chromatografii s UV a hmotnostní spektrometrií (LC-UV-MS) nabízí robustní a spolehlivý přístup splňující požadavky na kvalitu a shodu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ukázat implementaci plně automatizovaného eWorkflow v systému Chromeleon CDS pro intaktní potvrzení hmotnosti modifikovaných oligonukleotidů. Testováno bylo pět 20mer fosforotioátových variant se 1–5 modifikacemi.

Použitá metodika

Vzorky byly připraveny rehydratací na koncentraci ~2,0 pmol/µl a injikovány v objemu 2 µl. Chromatografie byla provedena IP-RP metodou trap-and-elute na kolonce DNAPac RP (2,1×50 mm, 4 µm) s mobilními fázemi obsahujícími HFIP a TEA ve vodě a methanolu. Gradientní eluce trval 1,6 minuty a zajišťoval rychlé odplavení nečistot. Hmotnostní spektrometrie v režimu negativní ionizace (HESI) zaznamenávala rozsah 600–2000 m/z. Data byla zpracována pomocí algoritmu ReSpect (Intact Protein Deconvolution) v Chromeleon CDS.

Použitá instrumentace

• Vanquish Flex UHPLC (systémová báze, binární pumpa, split sampler, kolonnový ohřívač, UV detektor)
• ISQ EM single quadrupole mass spectrometer
• Chromeleon Chromatography Data System verze 7.3.2 s eWorkflow
• Thermo Scientific BioPharma Finder 5.2 pro kalkulaci cílové hmotnosti

Hlavní výsledky a diskuse

Všechny vzorky měly retenční časy kolem 0,7–0,9 minuty. Trap-and-elute krok efektivně odstranil neprivázané nečistoty před MS analýzou. Dekonvoluce plných MS spekter ukázala odchylky průměrné hmotnosti 0,4–1,6 Da (průměr 0,77 Da), což je v rámci nastavené tolerance ±2 Da. Všechny vzorky úspěšně prošly testem „Pass“ a bylo automaticky vygenerováno přehledné shrnutí výsledků.

Přínosy a praktické využití metody

• Úplná automatizace od injekce po report
• Kompliance-ready řešení splňující regulační požadavky
• Snadná replikace a sdílení eWorkflow mezi laboratořemi
• Zrychlení rutinní kontroly kvality oligonukleotidů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na delší a další chemicky modifikované sekvence
• Integrace s cloudovými platformami a vzdáleným dohledem nad procesy
• Využití strojového učení pro pokročilou interpretaci dat
• Aplikace na multiatributní analýzu a vyšší rozlišení MS

Závěr

Ukázali jsme, že generic eWorkflow v Chromeleon CDS na platformě Vanquish Flex UHPLC a ISQ EM MS umožňuje rychlou a spolehlivou intaktní hmotnostní analýzu modifikovaných oligonukleotidů s automatizovanou dekonvolucí dat a generováním reportů, splňující nároky na kvalitu a auditní stopu.

Reference

1. Thermo Fisher Scientific. High-throughput analysis of oligonucleotides using a single quadrupole mass spectrometer for quality control. Application Note 000457.