Analysis of Monoclonal Antibodies and Their Fragments by Size Exclusion Chromatography Coupled with an Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

Monoklonální protilátky (MAb) představují klíčovou skupinu bioterapeutických látek. Pro jejich schválení i následnou výrobu je nezbytné provést komplexní charakterizaci čistoty, agregátů, posttranslačních modifikací a variací náboje, protože nepříznivé formy mohou vyvolat nežádoucí imunitní reakce.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo demonstrovat platformu SEC-MS (size-exclusion chromatography–mass spectrometry) využívající Orbitrap Exactive Plus EMR pro měření intact MAb v nondenaturačních podmínkách a pro detailní analýzu fragmentů (HC, LC, Fab, Fc) pod denaturačními podmínkami.

Použitá metodika a instrumentace

• Kolona MAbPac SEC-1, 4×300 mm, 5 µm
• HPLC systém Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 RSLCnano (SRD-3400 degasser, NCS-3500RS pumpa, WPS-3000TPL autosampler)
• Orbitrap Exactive Plus EMR (m/z 350–20 000, rozlišení 17 500–35 000)
• Nondenaturační eluční pufr: 20 mM amonný formiát nebo acetát (pH 6.3–6.8)
• Denaturační eluční pufr: 20 % acetonitril, 0.1 % formiová a 0.05 % trifluoroctová kyselina
• Redukce MAb: 20 mM DTT, 50 °C, 30 min
• Papainová štěpení: 1 mg/mL MAb, 0.04 mg/mL papain, pH 7.6, 37 °C, 4 h
• Software: Thermo Scientific Protein Deconvolution 2.0

Hlavní výsledky a diskuse

• Intaktní MAb bylo úspěšně detekováno za nondenaturačních podmínek; amonný formiát zachovává strukturu a je kompatibilní s MS.
• Orbitrap EMR zachytil nabití v rozsahu m/z >6000; dekonvoluce odhalila hlavní hmotnost ~148 033 Da, heterogenitu glykosylace (+162 Da) i C-terminální lyzin (+128 Da).
• Denaturační SEC-MS oddělila těžký řetězec (HC, ~50 614 Da) a lehký řetězec (LC, ~23 404 Da) a identifikovala varianty glykosylace a C-koncových zbytků.
• Papainem generované Fc fragmenty (eluce ~9.9 min) ukázaly glykanační heterogenitu a lyzinovou variantu, Fab fragmenty (~10.8 min) zůstaly bez glykosylace (~47 318 Da).

Přínosy a praktické využití metody

• SEC-MS kombinuje chromatografickou separaci intact protilátek a jejich fragmentů s přímou vysokorozlišenou masovou analýzou.
• Podpora QC biofarmak – sledování agregátů, variant posttranslačních modifikací a struktury v jednom kroku.
• Rychlý screening glykanačních profilů i C-terminálních variací bez nutnosti rozsáhlé přípravy vzorku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizované workflow integrující SEC-MS pro screening MAb a ADC v komplexních bioprocesech.
• Rozšíření metodiky na vyšší hmotnostní rozsahy a vícestupňové spektrometry pro analýzu větších komplexů a konjugátů.
• Vývoj nových biokompatibilních SEC kol s vyšším rozlišením a nižším koláží pro náročné aplikace.

Závěr

SEC-MS s Orbitrap Exactive Plus EMR a kolónou MAbPac SEC-1 představuje robustní nástroj pro přesné měření intact MAb i jejich fragmentů. Metoda prokazuje vysokou citlivost, schopnost detekce glykanačních a lyzinových variant a podporuje procesy kontroly kvality bioterapeutik.

Reference

• Lin, S., Rao, S., Thayer, J., Agroskin, Y., Pohl, C. Automated Monoclonal Antibody 2-Dimensional Workflow: from Harvest Cell Culture to Variant Analysis. WCBP Conference, San Francisco, CA, January 23–25, 2012.