Investigating process-related post-translational modifications in NISTmAb RM 8671 using high-throughput peptide mapping analysis

Význam tématu

Peptidové mapování hraje klíčovou roli při charakterizaci monoklonálních protilátek a dalších proteinových terapeutik. Umožňuje detailní popis primární struktury, identifikaci a kvantifikaci posttranslačních modifikací a zajišťuje důkaz identity a kvality léčiva. Standardní postupy jsou často časově náročné, náchylné ke vzniku přípravných artefaktů a obtížně automatizovatelné.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit účinnost a rychlost enzymatické digesce NISTmAb referenčního materiálu RM 8671 pomocí SMART Digest kitu. Časový průběh digesce (15 až 75 minut) byl testován z hlediska pokrytí sekvence protilátky a úrovně vzniklých posttranslačních modifikací, jako je deamidace, oxidace, glykace a glykosylace.

Použitá instrumentace

• SMART Digest Kit s immobilizovaným trypsinem
• Vanquish Flex Binary UHPLC systém
• Acclaim Vanquish C18 kolona 2,1 × 250 mm, 2,2 µm
• Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole Orbitrap hmotnostní spektrometr
• Nanodrop 2000 spektrofotometr
• MS-grade rozpouštědla a spotřební materiál

Použitá metodika

Vzorky NISTmAb (2 mg/ml) byly digesovány v SMART Digest kitu při 70 °C s mícháním 1 400 rpm po dobu 15, 30, 45, 60 a 75 minut. Po digesci následovala centrifugace, redukce disulfidů DTT (5 mM, 30 min, 37 °C) a ředění 0,1% kyselinou mravenčí. Na kolonu bylo aplikováno 3 µg peptidů v objemu 10 µl.
Chromatografie probíhala gradientem 2–40 % organické fáze B za 45 minut, průtok 0,3 ml/min, teplota kolony 25 °C a autosampler 5 °C. MS analýza byla provedena v režimu pozitivní ionizace, rozsah m/z 200–2 000, Full MS při rozlišení 70 000, MS2 (HCD 28) při 17 500. Data získaná v Xcaliburu byla zpracována v BioPharma Finderu 3.0.

Hlavní výsledky a diskuse

Postupy SMART Digest umožnily dosáhnout 100% pokrytí sekvence těžkého i lehkého řetězce již po 15 minutách digesce. Nejvyšší počet detekovaných peptidů (~1 360 komponent) byl zaznamenán při 30–45 minutách. Retenční časy byly vysoce stabilní (RSD ≤ 0,2 %).
Úroveň preparativně indukovaných posttranslačních modifikací byla nízká: deamidace zůstávala mezi 0,17 a 2,5 % pro většinu míst, pouze u N318 se zvýšila až na 10,6 % při 75minutové digesci. Oxidace methioninu a tryptofanu byla <3 %, glykace lysinu <1,6 %. Glykosylace na pozici N300 dominovaly formy A2G0F, A2G1F, A2G2F a M5, přičemž A2G1F představovala 33–40 %. Pyroglutamace na N-terminu byla >99 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazně zkrácený čas digesce na 30 minut oproti tradičním postupům trvajícím přes noc
• Vysoká reprodukovatelnost a konzistence intra- i interlaboratorních dat
• Minimalizace vzniku digesí indukovaných modifikací
• Vhodné pro vývoj, QA/QC a porovnávané studie monoklonálních protilátek
• Možnost integrace do automatizovaných vysoce průchodných platforem

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na další proteinová terapeutika
• Plná automatizace příprav a analýz peptidových map
• Optimalizace podmínek pro snížení vzniku teplotou či pH podmíněných modifikací
• Implementace metody pro kontinuální monitoring výrobních procesů a regulační dokumentaci

Závěr

Studie potvrdila, že kombinace SMART Digest kitu s Vanquish Flex UHPLC a Orbitrap hmotnostní spektrometrií umožňuje rychlé, spolehlivé a vysoce reprodukovatelné peptidové mapování monoklonálních protilátek s plným pokrytím sekvence a minimálním vznikem artefaktů. Metoda je ideální pro vývoj a rutinní kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

1. Reichert JM. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 2017;9(2):167–181.
2. Gucinski AC, Boyne MT. Evaluation of intact mass spectrometry for the quantitative analysis of protein therapeutics. Anal Chem. 2012;84(18):8045–8051.
3. Jefferis R. Posttranslational Modifications and the immunogenicity of Biotherapeutics. J Immunol Res. 2016;2016:1–15.
4. Beck A, Wagner-Rousset E, Ayoub D et al. Characterization of Therapeutic Antibodies and related products. Anal Chem. 2013;85:715–736.
5. European Medicines Agency. ICH Topic Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products. EMA; 1999.
6. Zhong X, Wright JF. Biological insights into therapeutic protein modifications throughout trafficking and their biopharmaceutical applications. Int J Cell Biol. 2013;2013:1–19.
7. Thermo Scientific. SMART Digest Kit User Manual, Version 2, 2016.
8. Tarlov MJ, Choquette SJ. Reference Material 8671. NIST Report of Investigation; 2016.
9. Samonig M, Schwahn A, Cook K et al. SMART Digest compared to classic in-solution digestion of rituximab for in-depth peptide mapping characterization. Thermo Scientific Application Note No. 1159; 2016.
10. Chelius D, Jing K, Lueras A et al. Formation of pyroglutamic acid from N-terminal glutamic acid in immunoglobulin gamma antibodies. Anal Chem. 2006;78(7):2370–2376.
11. Raju TS, Jordan RE. Galactosylation variations in marketed therapeutic antibodies. mAbs. 2012;4:385–391.
12. Pacis E, Yu M, Autsen J, Bayer R, Li F. Effects of cell culture conditions on antibody N-linked glycosylation. Biotechnol Bioeng. 2011;108:2348–2358.
13. Vlasak J, Bussat MC, Wang S et al. Identification and characterization of asparagine deamidation in the light chain CDR1 of a humanized IgG1 antibody. Anal Biochem. 2009;392:145–154.
14. Wang W, Vlasak J, Li Y et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Mol Immunol. 2011;48:860–866.
15. Dick LW, Mahin D, Qiu D et al. Peptide mapping of therapeutic monoclonal antibodies: Improvements for increased speed and fewer artifacts. J Chromatogr B. 2009;877:230–236.