Analysis of compounds in mobile phases with high pH

Význam tématu

High-pH chromatografie rozšiřuje možnosti analýzy zásaditých a ionizovatelných sloučenin, které při běžných podmínkách vykazují nízkou retenci. Metal-free konstrukce Bio-inert systému eliminuje korozi a kontaminaci při práci v širokém pH rozsahu až do pH 13–14.

Cíle a přehled studie

Studie ověřuje použitelnost Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC pro obecné vysokopH aplikace. Testovacími vzorky byly čtyři β-blokátory jako zástupci malých molekul a tryptický digest BSA jako model biomolekul. Hlavním cílem bylo sledování stability retence a rozlišení během desítek hodin.

Použitá metodika a instrumentace

Bio-inertní LC systém zahrnoval čtyřkanálové pumpu G5611A, bio-inert autosampler G5667A, DAD detektor G1315D s bio-inertní kyvetou a termostatovanou kolonu G1316C.
Kolona: ZORBAX Extend-C18, 4,6×100 mm, 1,8 µm.
Software: Agilent OpenLAB CDS ChemStation Edition C.01.02.
Eluenty:

• β-blokátory: 50 mM triethylamin (pH 11) / methanol, gradient 45→80→95 % B, 1 mL/min, 35 °C, detekce při 260 a 300 nm.
• Peptidy: 15 mM NH₄OH (pH 10) / 90 % acetonitril s 15 mM NH₄OH, gradient 5→30→100 % B, 1 mL/min, 35 °C, detekce při 214 nm.

Hlavní výsledky a diskuse

Retenční časy β-blokátorů vykázaly RSD < 0,2 % během 20 hodin (1 200 min) bez driftu. Rozlišení tří sousedních piků zůstalo stabilní. Tryptický BSA digest prokázal stabilitu retenčních časů čtyř vybraných peptidů po dobu 37,5 hodiny (2 250 min). VysokopH eluenty (pH 10–11) neměly negativní dopad na reprodukovatelnost ani kvalitu separace.

Přínosy a praktické využití metody

Bio-inertní LC systém umožňuje spolehlivou dlouhodobou provozní stabilitu v agresivním pH prostředí. Metoda je vhodná pro farmaceutické analýzy malých molekul i pro proteomické aplikace, kde je klíčová minimalizace kovové kontaminace a vysoká reprodukovatelnost.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace s hmotnostní spektrometrií pro komplexní analýzu biomolekul, rozšíření na vysokopH separace peptidů a proteinů, automatizace a zrychlení metodiky pro vysokoprůchodové aplikace v chemickém a farmaceutickém výzkumu.

Závěr

Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC potvrzuje robustní výkon a vysokou stabilitu při vysokém pH. Metoda je ověřena pro malé i středně velké molekuly a umožňuje spolehlivou, reprodukovatelnou analýzu v širokém pH rozsahu.

Reference

1. Proof of Performance – Determination of low-metal release from the Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC system with ICP-MS, Agilent Technologies, publication 5990-9352EN, 2011.
2. Peng I., Farkas T. Analysis of basic compounds by reversed-phase liquid chromatography–electrospray mass spectrometry in high-pH mobile phases. Journal of Chromatography A, 1179:131–144, 2008.
3. Using the High-pH Stability of ZORBAX Poroshell 300Extend-C18 to increase Signal-to-Noise in LC/MS, Agilent Technologies, publication 5989-0683, 2004.