Rapid Identification of Bacillus Spores by MALDImini™-1 Compact MALDI Digital Ion Trap (DIT) Mass Spectrometer

Význam tématu

Identifikace bakteriálních druhů je klíčová pro výběr účinných antibiotik a zajištění bezpečnosti potravin.
MALDI-TOF MS je široce využívaná pro rychlou mikrobiální analýzu, ale tradičně má omezení při identifikaci sporotvorných bakterií nebo v případě smíšených kultur.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit workflow pro rychlou identifikaci spor Bacillus subtilis pomocí kombinace on-plate tryptické digesce a MALDI-DIT MS/MS s přenosným přístrojem MALDImini-1.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek: spory Bacillus subtilis subsp. subtilis NBRC 13719T kultivované na živném médiu při 30 °C po dobu 1 týdne.
Postup:

• Nanesení bakteriálních buněk na MALDI cílovou desku a aplikace 1 µl 10 % trifluoroctové kyseliny pro extrakci proteinů
• Přidání 2 µl trypsinových kuliček (ProteoChem) a inkubace při 37 °C po dobu 30 min ve vlhkém prostředí
• Nanesení 1 µl matrice (α-cyano-4-hydroxycinnamová kyselina) a osušení
• MS a MS/MS analýza na MALDImini-1 Compact MALDI-DIT Mass Spectrometer (Shimadzu)

Databázové vyhledávání: MS/MS iontové vyhledávání (Mascot), ověření sekvence pomocí BLAST.

Hlavní výsledky a diskuse

V MS spektru digesovaných spor byly detekovány proteolytické peptidy, klíčový vrchol m/z 1879 byl podroben MS/MS analýze.
Mascot identifikoval malý kyselinou rozpustný sporný protein (SASP) z B. subtilis.
BLAST potvrdil, že sekvence peptidu je unikátní pro B. subtilis a odlišuje se od příbuzných druhů B. cereus a B. anthracis.
MALDImini-1 ocenili uživatelé pro jeho kompaktní rozměry a možnost umístění přímo v přípravné zóně.

Přínosy a praktické využití metody

On-plate digesce s immobilizovaným trypsinem snižuje dobu přípravy na desetiny hodin oproti standardním postupům.
Kombinace s MALDI-DIT umožňuje cílený výběr prekurzorů i ve složitých směsích.
Metoda je vhodná pro rychlé bio-bezpečnostní screenování a terénní detekci spor.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření workflow na další sporotvorné rody a směsi kultur.
Integrace s mikrofluidními a automatizovanými systémy přípravy vzorků.
Využití MS3 funkce MALDI-DIT pro analýzu posttranslačních modifikací, glykopeptidů a větvených glykánů.
Vývoj přenosných zařízení pro nasazení v místě odebrání vzorku.

Závěr

Popsaný postup umožňuje rychlou a spolehlivou identifikaci bakteriálních spor pomocí on-plate tryptické digesce a MALDI-DIT MS/MS.
Kompaktní MALDImini-1 umožňuje přímou instalaci v laboratorních i polních podmínkách a zrychluje celý analytický proces.

Reference

• B. Warscheid a C. Fenselau (2003), Characterization of Bacillus Spore Species and Their Mixtures Using Postsource Decay with a Curved-Field Reflectron. Anal. Chem. 75:5618–5627.