Performance Evaluation of Microbial Identification Using a Benchtop MALDI-TOF MS

Význam tématu

Microbiální identifikace je klíčová pro výzkum, kontrolu kvality a řízení rizik v medicíně, potravinářství a environmentálních aplikacích. Rychlá a spolehlivá identifikace mikroorganismů umožňuje efektivní rozhodování v rutinních laboratorních provozech i v kritických situacích. Metody MALDI-TOF MS se staly preferovanou technikou pro on-site testování díky jednoduché přípravě vzorku a krátkému času analýzy, avšak tradiční otiskové přístupy narážejí na omezení při chybějících referenčních spektrech a u fylogeneticky velmi příbuzných taxonů.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyhodnotit výkonnost kombinace bench-top MALDI-TOF MS systému MALDI-8030 EasyCare a cloudového proteomického identifikačního softwaru MicrobialTrack při identifikaci 50 bakteriálních kmenů s vysokými nároky z oblasti výzkumu, potravin a průmyslu. Studie se zaměřila na porovnání běžných postupů přípravy vzorku (direct smear, on-plate formic acid, in-tube ethanol/formic acid–acetonitrile) a na schopnost softwaru spolehlivě přiřadit druhy za použití předpovězené databáze teoretických hmotností proteinů (>80 000 záznamů).

Použitá metodika

Bylo testováno 50 kmenů získaných z veřejných sbírek NBRC a JCM. Kultivace proběhla na standardních agarech při 30 °C po dobu 24 h. Vzorky byly zpracovány třemi metodami:

• Direct smear (DS): přímé nanesení kolonie na target, následné přidání 1 µL matrixy.
• On-plate formic acid extraction (FA): nanesení kolonie, 0,5 µL 25 % formiové kyseliny na místo, vysušení a aplikace matrixy.
• In-tube ethanol + formic acid/acetonitrile extraction (EtOH): mytí v 80 % ethanolu, extrakce 70 % formiovou kyselinou + acetonitrilem, nanesení supernatantu a matrixy.

Spectra byla získána na MALDI-8030 EasyCare v lineárním pozitivním módu v rozsahu m/z 3 500–20 000. Kalibrace hmotnostního měřítka proběhla pomocí Escherichia coli DH5α Electro-Cells (Takara Bio). Spektra exportovaná do ASCII byla analyzována v MicrobialTrack, který porovnává experimentální spektra s databází teoretických proteinových hmotností odvozených z genomických dat (GTDB nomenklatura).

Použitá instrumentace

• MALDI-8030 EasyCare (benchtop MALDI-TOF MS)
• MicrobialTrack (cloud-based proteomics identification software, databáze >80 000 taxonomicky klasifikovaných prokaryotických genomů)
• Matrix: α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) 10 mg/mL v roztoku 1 % TFA / 15 % etanol / acetonitril
• Kalibrační materiál: Escherichia coli DH5α Electro-Cells (Takara Bio)

Hlavní výsledky a diskuse

Při počátečním zpracování metodou DS dosáhlo 47 ze 50 kmenů (94 %) hodnocení identifikační důvěryhodnosti High nebo Very High; u 46 kmenů byla potvrzena shoda s referenčním druhem. Čtyři kmeny vykazovaly zpočátku nižší důvěryhodnost (Middle/Low) a byly znovu analyzovány po aplikaci FA nebo EtOH protokolů. U tří z nich (Lentilactobacillus hilgardii, Levilactobacillus brevis, Micrococcus luteus) se důvěra zvýšila na Very High a byla potvrzena shoda s referencí, což dokládá, že optimalizace přípravy vzorku významně zlepšuje úspěšnost identifikace, zejména u Gram-pozitivních taxa s pevnými buněčnými stěnami.

Studie dále ilustruje limity MALDI-TOF MS při rozlišování velmi blízce příbuzných druhů na příkladu Bacillus amyloliquefaciens a Bacillus velezensis. U testovaného kmene NBRC 3007 byly detekovány ribozomální proteiny identické mezi oběma typovými kmeny; teoretické hmotnosti se shodovaly >80 %, a proto MALDI-TOF MS neposkytl jednoznačné rozlišení. Autoři zdůrazňují, že u „komplexů“ druhů s vysokou proteomickou podobností je vhodné upřednostnit genomické přístupy (ANI, whole-genome analysis) nebo specifické genové markery pro definitivní taxonomické určení.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá, vysoce reprodukovatelná identifikace bakterií s minimální přípravou vzorku vhodná pro rutinní laboratorní provozy, kontrolu kvality a výzkum.
• Cloudová, proteomicky orientovaná databáze >80 000 záznamů eliminuje nutnost rozsáhlých domácích knihoven spekter a zrychluje nasazení v provozech.
• Flexibilita v postupu přípravy vzorku (DS → FA → EtOH) umožňuje adaptaci na různé typy organismů a zlepšení výsledků bez investic do dalších instrumentálních metod.
• Systém rozpoznává taxonomické nejistoty a v případech vysoké podobnosti uvádí kandidáty nebo „species complex“, čímž snižuje riziko mylně přesvědčivých jednoznačných výstupů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují rozšíření a časté aktualizace předpovědné databáze vzhledem k rychlým změnám taxonomie, integraci MALDI-TOF MS výsledků s genomickými daty pro lepší rozlišení v rámci druhových komplexů a širší nasazení cloudových algoritmů s pokročilou anotací proteinů. Kombinace rychlé proteomiky s cílenými molekulárními testy (např. PCR nebo WGS) pro kritické případy by mohla nabídnout optimální poměr rychlosti a přesnosti. Dále je prostor pro automatizaci přípravy vzorků a validaci protokolů pro specifické průmyslové matice (potraviny, fermentace, environmentální vzorky).

Závěr

Studie prokázala, že kombinace MALDI-8030 EasyCare a MicrobialTrack poskytuje rychlé a vysoce spolehlivé identifikační výsledky pro široké spektrum bakteriálních kmenů za použití jednoduchých pracovních postupů. Správná volba a optimalizace metody přípravy vzorku výrazně zvyšuje identifikační důvěryhodnost, zatímco proteomická předpovědná databáze umožňuje provoz bez rozsáhlých lokálních knihoven. Nicméně pro taxonomicky složité skupiny je doporučeno doplnit analýzu genomickými přístupy.

Reference

1. Fan B., Blom J., Klenk H., Borriss R. Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, and Bacillus siamensis Form an “Operational Group B. amyloliquefaciens” within the B. subtilis Species Complex. Frontiers in Microbiology. 2017 Jan 20;8:22.