Analysis of Modification Site of Chemically Modified Antibody Using MALDImini™-1 Compact MALDI Digital Ion Trap Mass Spectrometer

Význam tématu

Antibody–drug conjugáty (ADC) představují perspektivní třídu cílených protinádorových léčiv, která spojují vysokou specificitu protilátky s toxickou účinností nízkomolekulárního činidla. Klíčovým krokem ve vývoji a kontrole kvality ADC je přesné určení stupně a místa chemické modifikace proteinu. Kompaktní MALDImini-1 s digitálním iontovým pastí nabízí uživatelům rychlou a citlivou alternativu pro lokalizaci modifikačních pozic bez potřeby rozsáhlého laboratorního vybavení.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat schopnost přístroje MALDImini-1 pokročilé analýzy modifikačních míst na modelové protilátce uměle navázané nízkomolekulární fluorescenční skupině Me-fluorescein-ABNO. Pro srovnání byly zhotoveny dva vzorky: standardní lidská protilátka NISTmAb a její pseudo-ADC úprava na zbytku tryptofanu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro detailní mapování míst modifikací byly aplikovány následující postupy a přístroje:

• Enzymatická štěpná digesce trypsinem obou vzorků.
• Desalting s použitím ZipTip μC18.
• MALDI-MS analýza na kompaktním MALDImini-1 digitálním iontovém pastním spektrometru.
• Matricová látka: 2,5-dihydroxybenzoová kyselina (DHB).
• Multistupňová MSn analýza (MS, MS/MS, MS3).

Hlavní výsledky a diskuse

Srovnáním hmotnostních spekter modifikované a nemodifikované protilátky byly identifikovány čtyři ionty unikátní pro modifikovaný vzorek (m/z 2416,9; 2430,7; 2452,7; 2560,9). Doplňující MS/MS a MS3 analýzy dovolily přiřadit dva z těchto signálů k peptidům ze sekvence těžkého řetězce:

• Peptid 278–291 (FNWYVDGVEVHNAK) s modifikací na Trp.
• Peptid 305–320 (WSVLTVLHQDWLNGK) rovněž s modifikací na Trp.

Výsledky nasvědčují, že v jedné molekule IgG může být celkem až čtyři modifikační skupiny (dva těžké řetězce × dva Trp rezidua). Analýza potvrdila vysokou selektivitu Me-fluorescein-ABNO k tryptofanovým zbytkům a prokázala plný analytický výkon zařízení MALDImini-1 i na úrovni MSn.

Přínosy a praktické využití metody

Compactní MALDImini-1 umožňuje:

• Rychlou identifikaci lokalizovaných modifikací pro QC a vývoj ADC.
• Šetření vzorku i spotřebu činidel díky citlivému měření v malém objemu.
• Rozšíření analytických kapacit laboratoří s omezeným prostorem.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikací MALDI-MSn v oblasti biokonjugací a detekce dalších posttranslačních modifikací. Další miniaturizace, automatizace připravy vzorků a integrace s vysoce výkonnými chromatografickými technikami umožní zvýšení propustnosti a hlubší charakterizaci komplexních biologických látek.

Závěr

Studie potvrdila, že kompaktní MALDImini-1 DIT spektrometr poskytuje dostatečnou citlivost a selektivitu pro lokalizaci modifikačních míst na protilátkách. Metoda je vhodná pro rutinní QC ADC a pro výzkumné laboratoře se zájmem o detailní mapování biokonjugací.

Reference

1. Yohei Seki, Takashi Ishiyama, Daisuke Sasaki, Junpei Abe, Youhei Sohma, Kounosuke Oisaki, Motomu Kanai. Transition Metal-Free Tryptophan-Selective Bioconjugation of Proteins. J. Am. Chem. Soc. 2016;138(34):10798–10801.