Quantification of Monoclonal Antibody Trastuzumab in Mouse Plasma with the Agilent 1290 Infinity II Bio LC and Agilent 6495 Triple Quadrupole LC/MS Systems

Význam tématu

Monoklonální protilátky, jako je trastuzumab, představují klíčovou terapeutickou třídu v léčbě řady onemocnění, včetně HER2-pozitivních nádorů prsu a žaludku. Rychlý růst trhu s mAb vyžaduje robustní, citlivé a specifické analytické metody pro kvantifikaci v biologických matricích. Tradiční ligandové vazebné testy nabízejí vysokou průchodnost a nízké náklady, ale často postrádají selektivitu a vyžadují vývoj specifických protilátek. Naopak LC/MS umožňuje selektivitu, široký dynamický rozsah a rychlý vývoj metod bez závislosti na nových rekvizitách.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat hybridní workflow kombinující imunoprecipitaci (LBA) a LC/MS pro kvantifikaci trastuzumabu v malomysí plasmatické matrici. Použitá platforma – Agilent 1290 Infinity II Bio LC spojená s Agilent 6495 Triple Quadrupole – byla optimalizována tak, aby dosáhla nízké meze kvantifikace, vynikající specificity a minimu doby vývoje metody.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a detekci byl nasazen LC systém Agilent 1290 Infinity II Bio LC v konfiguraci High Speed Pump, multisampler a termostatovaná kolona s bio heat exchangerem, spojený s triple kvadrupólem Agilent 6495 s Agilent Jet Stream zdrojem.

• Imunoadsorpce: biotinylovaný anti-Fc protilátkový ligand na streptavidinových magnetických perličkách
• Detekce surrogate peptidů po tryptickém štěpení (IYPTNGYTR, FTISADTSK, GPSVFPLAPSSK)
• Separace na Agilent Poroshell EC-C18 (2,1×50 mm, 2,7 µm), gradient 5–90 % ACN s formovou kyselinou
• MS parametry: pozitivní ESI, MRM přechody optimalizované na kvantifikátory i konfirmační ionty

Hlavní výsledky a diskuse

Nižší mez kvantifikace (LLOQ) byla stanovena na 5 ng/mL při použití pouhých 50 µL plasmy. Kalibrační rozsah od 5 do 2 000 ng/mL vykazoval kvadratické fitování s váhou 1/x2 a hodnoty R2 > 0,98 pro všechny tři surrogate peptidy. Rozdíly mezi naměřenými a nominálními koncentracemi (% bias) byly v rozmezí ±9 % a opakovatelnost (% CV) pod 14 % napříč celým rozsahem.

Přínosy a praktické využití metody

Hybridní LBA/LC/MS workflow nabízí:

• Vysokou selektivitu eliminací křížové reaktivity
• Citlivost kompatibilní s požadavky preklinického a klinického vývoje
• Minimalizaci času na vývoj metody bez potřeby nové protilátky pro každou mAb

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření přístupu na multiplexní analýzu více mAb současně, integrace s vysoce rozlišovacími hmotnostními spektrometry a plná automatizace přípravy vzorků. Podobné strategie lze adaptovat pro biosimilars a další proteinové lékárny.

Závěr

Vyvinutý hybridní workflow na platformě Agilent 1290 Infinity II Bio LC a 6495 Triple Quadrupole LC/MS umožňuje rychlou, citlivou a vysoce specifickou kvantifikaci trastuzumabu v malomysí plasmatické matrici, s limitem stanovení 5 ng/mL a širokým dynamickým rozsahem. Metoda je univerzálně použitelná i pro další humanizované protilátky.

Reference

1. Allied Market Research Latest Reports
2. Jenkins R. et al. Recommendations for Validation of LC–MS/MS Bioanalytical Methods for Protein Biotherapeutics. AAPS J. 2015, 17(1), 1–16
3. Boekhout A. H., Beijnen J. H., Schellens J. H. M. Trastuzumab. Oncologist 2011, 16(6), 800–810