Precision Microvolume Spectrophotometry of Lysosyme at 100mg/ml

Význam tématu

Proteinová analýza v mikroobjemu je zásadní pro biochemický výzkum, farmaceutické aplikace a průmyslovou kontrolu kvality. Tradiční spektrofotometry vyžadují desítky až stovky mikrolitrů vzorku a dosahují omezeného dynamického rozsahu. Nové mikromnožstevní kyvety umožňují přesné měření absorpčních vlastností proteinů již od 1 µl objemu, čímž se překonává dosavadní bariéra v analýze vysoce koncentrovaných i řídce rozptýlených vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit výkonnost mikromnožstevní kyvety Hellma Traycell v kombinaci se spektrofotometrem Agilent Cary 6000i při stanovení absorbance lysozymu v koncentraci 100 mg/ml. Studie se soustředila na měření v UV/VIS regionu (200–380 nm), s důrazem na reprodukovatelnost, citlivost a liniaritu v extrémním rozsahu koncentrací.

Použitá metodika a instrumentace

Popis metodiky:

• Příprava vzorku: Lysozym 100 mg/ml ve vodě bez iontů.
• Nastavení spektrofotometru: šířka pásma 2 nm, rychlost skenu 60 nm/min, průměrovací doba 2 s, interval dat 2 nm.
• Traycell montáž: kalibrace na 3,8 % průsvitu a použití zadního tlumiče pro kompenzaci interní absorpce kyvety (1,3 Abs).

Instrumentace:

• Agilent Cary 6000i (případně Cary 4000/5000) se zadními beam attenuátory.
• Hellma Traycell s dráhou světla 0,2 mm (1 µl objemu).

Hlavní výsledky a diskuse

Měření prokázala nízkou úroveň šumu (±0,0002 Abs) a stabilní baselinu (±0,0006 Abs). Očekávaný vrchol absorbance při 280 nm se v koncentraci 100 mg/ml neobjevil; místo toho se zobrazil plošný region okolo 2 Abs. Výsledky byly reprodukovatelné i po 12 minutách prodlevy mezi skeny. Tento jev poukazuje na možnou molekulární asociaci, změnu struktury nebo nové vazebné interakce při vysoké koncentraci.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Kvantifikaci proteinů v rozsahu od 20 µg/ml do 100 000 µg/ml v objemech 1–4 µl.
• Provádění čistotních skenů i u malých objemů a vysokých koncentrací.
• Efektivní úsporu vzorku a snížení nákladů na reagencie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření mikromnožstevní spektrofotometrie v proteomice, biofarmaceutickém vývoji a nanoaplikacích. Doporučuje se:

• Přesná ředění a porovnání různých drah světla pro verifikaci jevů.
• Studium interakcí protein–protein a protein–rozpouštědlo při vysokých koncentracích.
• Integrace s automatizačními platformami pro vysokopropustné analýzy.

Závěr

Ukázalo se, že spojení Traycell mikrokyvety a spektrofotometru Cary 6000i nabízí vynikající citlivost a dynamický rozsah pro analýzu proteinů v rozsahu od ng až po stovky mg/ml. Nečekaný plošný průběh absorbance lysozymu při vysoké koncentraci naznačuje nový fyzikální jev vyžadující další experimentální ověření.

Reference

Ve zdrojovém dokumentu nebyly uvedeny explicitní literární odkazy.