Accuracy in Microvolume Measurements. Investigating the Precision and Reproducibility of Cary 50, 300 and 4000 series Instruments for Microlitre samples

Význam tématu

Analýza mikroobjemů UV/Vis spektrofotometrií umožňuje přesné stanovení koncentrace DNA, proteinů a dalších biomolekul i při velmi malém objemu vzorku. Tato metoda nachází uplatnění v molekulární biologii, klinických laboratořích a farmaceutickém výzkumu, kde je vzorek často omezený a potřebná rychlost a citlivost měření vysoká.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat přesnost a reprodukovatelnost tří modelů spektrofotometrů Cary (50, 300 a 4000) v kombinaci s mikroobjemovým adaptérem Hellma TrayCell. Posuzovaly se limity detekce DNA, šum, linearita a schopnost kinetických měření v mikroobjemech.

Použitá metodika a instrumentace

Laboratorní postup zahrnoval:

• Kalibraci a zarovnání Cary 50, 300 a 4000 pomocí softwarového modulu Align a mechanických šroubů.
• Měření řady vzorků ssDNA v různých koncentracích (0,5–50 µg/µl) v mikroobjemových (0,2–1,0 mm) a konvenčních kyvetách.
• Sledování stability signálu při opakovaných skenech a kinetických experimentech (enzymový test fosfitu).

Použitá instrumentace

• Cary 50 UV/Vis spektrofotometr se xenonovou výbojkou, 1,5 nm šířkou pásma, ultrarychlým skenováním a vláknovými mikrocuppetami Hellma TrayCell.
• Cary 300 výzkumný duální spektrofotometr s přesností odčtu 0,0002 Abs a rozsahem až 5 Abs.
• Cary 4000 špičkový spektrofotometr s pravou duální monochromací, dynamickým rozsahem >9 Abs a šumem na bázi 0,0001 Abs.
• Hellma TrayCell mikroobjemový víceprůchodový adaptér pro vzorky od 0,5 µl do 4 µl.

Hlavní výsledky a diskuse

• Cary 50 spolehlivě kvantifikoval DNA v rozmezí 2–5 ng/µl s kvantifikační chybou kolem 3 %; pod 5 ng/µl se výrazně zvyšuje šum až 20 % signálu.
• Cary 300 nabídnul srovnatelnou přesnost jako Cary 50, avšak s rozšířenou lineární dynamikou až do 4 Abs při 1 mm dráze.
• Cary 4000 umožnil detekci ssDNA až 0,5 µg/µl s kvantifikační chybou přibližně 10 % a šumem pod 0,0001 Abs; reprodukovatelnost výsledků byla lepší než 1 %.
• Opakovaná měření a kinetické studie potvrdily minimální odpařování vzorku v TrayCellu a stabilní signál během desítek minut.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá analýza s minimální spotřebou vzorku (0,5–4 µl).
• Imunita vůči okolnímu osvětlení bez nutnosti uzavírání krytu.
• Možnost přímé výměny mezi mikroobjemovými a konvenčními kyvetami.
• Vhodné pro kvantifikaci nukleových kyselin, proteinů i pro kinetické enzymové testy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace mikrofluidických čipů pro plně automatizované vysokopropustné analýzy.
• Další zvyšování citlivosti pomocí nových typů detektorů a adaptérů s kratší optickou drahou.
• Rozšíření aplikací na komplexní biomolekulární testy (interakce protein–DNA, real-time kinetika enzymů).
• Propojení s laboratorními informačními systémy a vzdálená správa měření.

Závěr

Při mikroobjemové spektrofotometrické analýze DNA nabízí Cary 50 v kombinaci s Hellma TrayCell rychlou a dostatečně přesnou platformu pro běžné aplikace. Pro nejvyšší požadavky na citlivost a šum je ale výhodnější použít Cary 4000. Cary 300 zaujme střední cestu s rozšířeným dynamickým rozsahem a mírně vyšší odolností proti šumu.

Reference

• Keighley R. Accuracy in Microvolume Measurements. Sample Analysis Report No. 49, Varian Limited.
• Agilent Technologies. Agilent Cary UV/Vis Spectrophotometer Series Application Notes.