Examining Nanoscale LC Reproducibility with Coupling of the ACQUITY UPLC M- Class System to SELECT SERIES Cyclic IMS

Význam tématu

Nanoskopická kapalinová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií představuje klíčovou metodu pro proteomické analýzy, zejména při omezených množstvích vzorků a velkých kohortách. Reprodukovatelnost retenčního času, intenzity signálu a přesnosti měření je zásadní pro validní statistické vyhodnocení biomarkerů a zajištění integrity dat v průběhu dlouhodobých experimentů.

Cíle a přehled studie

Cílem briefu bylo ověřit dlouhodobou stabilitu a opakovatelnost nanoskopické LC-MS analýzy standardního E. coli tryptického digestu, aplikovaného jako kontrolní vzorek každých deset injekcí v rámci 23denního experimentu s odběrem vzorků z buněčných linií ovariálního karcinomu. Použit byl ACQUITY UPLC M-Class systém v režimu nanoskopické chromatografie a SELECT SERIES Cyclic IMS spektrometr v režimu HDMSE (mobility enabled DIA).

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: Waters MPDS E. coli tryptický digest, 100 ng/injekce.
• LC systém: ACQUITY UPLC M-Class;
   – Trapping column: Symmetry C18, 5 µm, 180 µm × 20 mm;
   – Analytical column: HSS T3, 1,8 µm, 75 µm × 250 mm;
   – Teplota kolony: 40 °C; vzorku: 10 °C; průtok 300 nL/min; gradient 5 → 35 % B/90 min.
• MS systém: SELECT SERIES Cyclic IMS; ESI+, rozlišení 50 000 FWHM, ion mobility single pass 65 FWHM; HDMSE, rozsah 50–2000 amu, injektážní čas 0,5 s; referenční injekce Glu-Fibrinopeptid B každé 120 s.
• Software: MassLynx, ProteinLynx Global Server, TIBCO Spotfire; databáze Uniprot E. coli; FDR 4 %.

Hlavní výsledky a diskuse

• Retenční čas: koeficient variační 1 % pro pět peptidů rozložených napříč 95min elucí.
• Intenzita signálu: CV < 20 % u 12 peptidů (box-and-whisker analýza).
• Hmotnostní přesnost: 82 % ze 275 000 peptidových měření v rámci ±2 ppm.
• Identifikace: průměrně ~1100 proteinů a ~22 000 peptidů na injekci;
   – 1000 proteinů opakovaně detekováno v ≥ 75 % běhů.
   – Sekvenční pokrytí u 12 proteinů 55–93 % (CV 3–5 %).
• Dynamický rozsah: fragmentní intenzity spolehlivě pokrývají 4 řády.

Přínosy a praktické využití metody

Nanoskopická LC-MS konfigurace prokázala výjimečnou robustnost a reprodukovatelnost, což umožňuje konzistentní identifikaci proteinů a kvantifikaci ve velkých kohortách. Metoda je vhodná pro studie biomarkerů, QA/QC procesy a dlouhodobé experimenty v proteomice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Implementace pokročilé iontové mobility a multidimenzionálních separací.
• Optimalizace pro ještě nižší průtoky a menší objemy vzorků.
• Automatizace a vyspělé algoritmy strojového učení pro analýzu komplexních dat.
• Rozšíření dynamického rozsahu a hloubky proteomické pokrytí.

Závěr

Spojení nanoskopické ACQUITY UPLC M-Class chromatografie a SELECT SERIES Cyclic IMS hmotnostního spektrometru v HDMSE režimu poskytuje stabilní a reprodukovatelné výsledky v dlouhodobých proteomických studiích, což zaručuje vysokou kvalitu dat a podporuje statistickou validitu rozsáhlých analýz.

Reference

• Hughes C., Gethings L. A., Plumb R. S. Qualitative and Quantitative Performance of Cyclic IMS in Nanoscale Proteomic Experiments. Waters Application Note 720007381, 2021.