Demonstrating the Applicability of the ACQUITY™ Premier Binary System for Long Shallow Gradient Peptide Mapping Analysis

Význam tématu

Reverzní fázová chromatografie peptidových map je zásadní pro charakterizaci bioterapeutik a jejich variantních forem. Díky dlouhým mělkým gradientům lze detailně rozlišit podobné peptidy, což napomáhá přesné kvalitativní i kvantitativní analýze proteinů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat výkon systému ACQUITY Premier Binary System od společnosti Waters s konkurenčním biokompatibilním UHPLC systémem v aplikaci dlouhého mělkého gradientu pro peptidové mapování standardu enolázy. Testování probíhalo pět dní se sledováním opakovatelnosti retence 21 peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byl použit MassPREP Enolase Digestion Standard rekonstituovaný v roztoku 0,1 % TFA ve vodě. Analýza probíhala kolonou Peptide CSH C18 2,1×150 mm při teplotě 65 °C a gradientu 0,58 % změny organické fáze za minutu po dobu 85 minut. Detekce byla vedena pomocí diodového array detektoru při 214 nm. Jako pumpy byly použity vysokotlaké binární moduly systémů ACQUITY Premier a konkurenčního UHPLC.

Hlavní výsledky a diskuse

Systém ACQUITY Premier dosáhl průměrné denní směrodatné odchylky retence 0,017 minuty napříč všemi peptidy a pěti dny. Konkurent dosáhl 0,030 minuty. Zlepšení u Premier systému se pohybovalo od 13 do 146 % podle jednotlivých peptidů. Nižší variability retence potvrzuje vyšší přesnost a reprodukovatelnost gradientu při dlouhých mělkých změnách složení mobilní fáze.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší opakovatelnost retence usnadňuje srovnávání peptidových map bez nutnosti pokročilých algoritmů pro korekci posunu špiček.
• Metoda podporuje přesnější monitorování kvality bioterapeutik, zejména monoklonálních protilátek.
• Vysoká přesnost gradientu je klíčová pro aplikace s UV i hmotnostní spektrometrií.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zlepšení systémové reproducibility zavedením inteligentních algoritmů pro adaptivní řízení poměru složek mobilní fáze a optimalizaci spotřeby rozpouštědel. Kombinace s multimodálními detektory a automatizovanými datovými workflow umožní rychlejší validaci a robustnější porovnávání peptidových profilů v průmyslové i regulační praxi.

Závěr

Study demonstrovala, že systém ACQUITY Premier Binary System poskytuje v rámci dlouhých mělkých gradientů lepší opakovatelnost retence než konkurenční systém. Díky tomu je vhodný pro náročné peptidové mapování a kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

1. Zhu R, Zacharias L, Wooding KM, Peng W, Mechref Y. Glycoprotein Enrichment Analytical Techniques Advantages and Disadvantages. Methods in Enzymology 2017;585:397–429.
2. Mitulovic G, Mechtler KH. HPLC Techniques for Proteomics Analysis a Short Overview of Latest Developments. Briefings in Functional Genomics 2006;5(4):249–260.
3. Gruber KA, Stein S, Brink L, Radhakrishnan A, Udenfriend S. Fluorometric Assay of Vasopressin and Oxytocin A General Approach to the Assay of Peptides in Tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences 1976;73(4):1314–1318.
4. Simeone J, Hong P, McConville PR. Performance of the ACQUITY UPLC I-Class PLUS System for Methods Which Employ Long Shallow Gradients. Waters Application Note 2018.