The Determination Method of the Lipophilic Marine Biotoxins in Bivalve Subject to EU Regulations Using a Triple Quadrupole Mass Spectromete

Význam tématu

Analýza lipofilních mořských biotoxinů v mlžích je klíčová pro ochranu spotřebitele a splnění přísných regulací EU a Japonska. Tyto toxiny se hromadí v organismu mlžů při filtraci dinoflagelát a mohou způsobit vážná otravná onemocnění. Vysoce citlivé, rychlé a spolehlivé metody jsou nezbytné pro rutinní monitoring a zajištění bezpečnosti potravin.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a ověřit kvantitativní LC–MS/MS metodu podle postupů EU-RL-MB pro simultánní stanovení pěti lipofilních mořských biotoxinů (okadaová kyselina, dinofyzistoxin-1, pectenotoxin-2, azaspiracid-1, yessotoxin) v extraktu z mušlí. Studie se zaměřila na použití zásaditého mobilního fáze, automatickou přípravu kalibračních křivek za matice a porovnání výsledků s i bez hydrolýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Pro extrakci a analýzu byla použita harmonizovaná SOP LC-MS/MS verze 5 EU-RL-MB. Klíčové parametry:

• Kapalinová chromatografie (Nexera): ODS kolona (100×2,1 mm, 3,5 µm) odolná vůči vysokému pH
• Mobilní fáze A – 2 mmol/l amoniakální hydrogenuhličitan (pH 11), B – acetonitril:2 mmol/l amoniakální hydrogenuhličitan (9:1, pH 11), gradient 25→100 % B v 1–11,4 min, návrat do 25 % B do 22 min, průtok 0,3 ml/min, teplota 40 °C, injekce 5 µl
• Hmotnostní spektrometrie (LCMS-8060): ESI pozitivní i negativní režim, voltáž +4 kV / –3 kV, dusík pro rozprašování a sušení, teplota rozhraní 350 / 200 / 450 °C, CID plyn 270 kPa
• MRM přechody pro každou sloučeninu (OA, DTX1, YTX v negativním iontovém režimu; PTX2, AZA1 v pozitivním) byly optimalizovány pro nejlepší citlivost.
• Autosampler s funkcí maticově‐přizpůsobené kalibrace: automatické aspirace extraktu a standardů v různých koncentracích pro tvorbu kalibračních křivek.

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrační křivky všech pěti toxinů vykázaly vynikající linearitu (R² 0,9997–0,99995). Obnova (recovery) přidaných standardů v extraktu se pohybovala mezi 95–105 % pro OA, DTX1 a YTX bez ohledu na hydrolýzu. Pectenotoxin-2 a azaspiracid-1 byly detekovatelné bez hydrolýzy, zatímco po hydrolýze nebyly detekovány (ND), což potvrzuje odbourání esterových forem. Citlivost metody umožňuje kvantifikaci toxinů na úrovni jednotek ng/ml v extraktu, odpovídající mikrogramovým limitům v kg tkáně.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Simultánní stanovení pěti regulačně významných toxinů v jediném běhu
• Vyšší citlivost pro yessotoxin díky zásadité mobilní fázi
• Automatizovanou tvorbu maticově‐přizpůsobených kalibračních křivek, redukci manuálních chyb a zrychlení analýzy
• Splnění požadavků EU a japonských předpisů pro monitoring bezpečnosti škeblí

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody na další mořské biotoxiny a matrice, integrace s vysokoprůtokovými automatizovanými systémy pro monitoring, využití HRMS pro nontarget screening a vývoj rychlejších chromatografických gradientů. Kombinace s bioinformatikou může zrychlit detekci nových toxinů a usnadnit rutinní QA/QC procesy v potravinářském průmyslu.

Závěr

Popsaná LC–MS/MS metoda pro simultánní analýzu lipofilních mořských biotoxinů je robustní, citlivá a splňuje přísné regulační limity. Automatizovaná příprava vzorků a kalibrace zajišťují vysokou přesnost a reprodukovatelnost, což ji činí vhodnou pro rutinní monitoring kvality mořských plodů.

Reference

1) EU-Harmonised Standard Operating Procedure for determination of Lipophilic marine biotoxins in molluscs by LC-MS/MS, Version 5, January 2015