UPLC/MS/MS Method for the Routine Quantification of Regulated and Non-Regulated Lipophilic Marine Biotoxins in Shellfish

Význam tématu

Kontrola přítomnosti lipofilních mořských biotoxinů ve sladkovodních a mořských korýších je klíčová pro ochranu veřejného zdraví. Tradiční bioasay založená na krmení zvířaty je eticky i vědecky problematická a nedokáže spolehlivě určit stopové koncentrace jednotlivých toxinů. Moderní chromatograficko-hmotnostní metody nabízí vyšší citlivost, specifitu a výrazně kratší doby analýzy, což podporuje rutinní monitoring a dodržování evropských regulací.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo navrhnout rychlou a robustní UPLC/MS/MS metodu pro kvantifikaci regulovaných i vybraných neregulovaných lipofilních biotoxinů v mušlích během pětiminutového běhu. Metoda zahrnuje jak karboxylové a sulfonové kyseliny (okadová kyselina, dinofysistoxiny, azaspiracidy, yessotoxiny), tak cyklické iminy (spirolidy, gymnodimin, pinnatoxiny), které dosud nejsou regulovány, ale jsou sledovány EFSA.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorkování a extrakce

• 1 g homogenizovaného celého masa korýšů extrahováno třikrát 3 mL methanolu.
• Po centrifugaci byly supernatanty sloučeny do 10 mL objemové nálevky a filtrovány 0,2 µm membránou.
• Pro stanovení esterů DTX3 proběhla alkalická hydrolýza (2,5 M NaOH, 76 °C, 40 min), následná neutralizace HCl.

Chromatografie a detekce

• Systém: ACQUITY UPLC s BEH C18 kolonkou (2,1×100 mm, 1,7 µm), teplota 40 °C, průtok 0,6 mL/min, analytický běh 5 min.
• Mobilní fáze A: voda s 6,7 mM NH4OH, B: 9:1 acetonitril/voda s 6,7 mM NH4OH, gradient od 30 % B na 90 % B a zpět.

Hmotnostní spektrometrie

• Xevo TQ-S s ESI v pozitivním a negativním módu střídavě.
• Metoda MRM pro každou sloučeninu dvě přechodové reakce (kvantifikace, potvrzení), optimalizované napětí a energie kolizí.
• Automatizované ladění a kontrola kvality pomocí IntelliStart a správu dat v TargetLynx s přístupem k protokolu v databázi Quanpedia.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla čtyřnásobného zkrácení doby analýzy oproti konvenční HPLC/MS/MS (20 min → 5 min) bez kompromisu v separačním rozlišení a kvalitě píků. Citlivost umožnila detekci na úrovni 0,125× validační hladiny se signál-šum ≥ 3. Matricově vázané kalibrace vykázaly R2 > 0,99 v rozsahu 0,125–1,5× povolených hladin. Průměrné zotavení toxinů bylo 91–108 %, opakovatelnost RSDr pro většinu toxinů < 10 %, s výjimkou formující se methylester PnTX-E (RSDr ≈ 23 %). Rozhodovací kritéria CCα indikují spolehlivou detekci nad povolenými limity. Metoda prokázala selektivitu i pro toxiny, pro které nebyly k dispozici standardy, na základě strukturálních analogií.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý rutinní monitoring v rámci oficiálních kontrolních programů EU namísto eticky sporné bioasay.
• Vysoká citlivost a specifita umožňují spolehlivé sledování širokého spektra lipofilních toxinů.
• Automatizovaná správa dat a integrované regulační limity usnadňují rozhodovací proces analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky o další neregulované sloučeniny na základě dostupnosti standardů a toxikologických dat.
• Uplatnění vysokorozlišené hmotnostní spektrometrie (HRMS) pro screening neznámých toxinů a metabolitů.
• Optimalizace hydrolytických kroků a automatizace přípravy vzorků pro zvýšení reprodukovatelnosti.
• Integrace výsledků do národních a mezinárodních databází pro podporu rizikových hodnocení.

Závěr

Vyvinutá UPLC/MS/MS metoda kombinuje extrémně rychlý běh, vysokou citlivost i selektivitu a splňuje požadavky EU na monitoring lipofilních mořských biotoxinů. Díky integraci do Quanpedia a automatizovanému ladění IntelliStart je snadno přenosná do jiných laboratoří a nahrazuje neetickou bioasay.

Reference

1. European Commission. Laying down implementing measures for certain products under Regulation (EC) No. 853/2004… Off J Eur Commun L 2005;338:40-41.
2. European Commission. Commission Regulation (EU) No 15/2011 of 10 January 2011 amending Regulation (EC) No 2074/2005 as regards recognized testing methods… Off J Eur Commun L 2011;L6:3-6.
3. Gerssen A, Mulder PPJ, McElhinney MA, De Boer J. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the detection of marine lipophilic toxins under alkaline conditions. J Chromatogr A 2009;1216:1421-1430.