Dynamic Binding Capacity of Oligonucleotides on PLRP-S Columns and Stationary Phases

Význam tématu

Analytická purifikace oligonukleotidů hraje klíčovou roli v biotechnologii, farmaceutickém výzkumu i diagnostice. Výběr správné stacionární fáze ovlivňuje efektivitu naložení analytu, kvalitu separace a výtěžek cílové sekvence.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo porovnat dynamickou vazební kapacitu (Dynamic Binding Capacity, DBC) oligonukleotidů různých délek (25, 50, 75, 100 nukleotidů) na polymerním reverzním fázi PLRP-S s pórovými velikostmi 100, 300, 1 000 a 4 000 Å. Vyhodnotit vliv pórové struktury na vazební kapacitu a hromadový přenos za podmínek iontově párované reverzní fáze.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace: Agilent 1260 Infinity II quaternary pumpa, autosampler s chlazením, termostatovaná kolona, Agilent 1290 Infinity II DAD detektor (262 nm).
• Kolony: PLRP-S PS/DVB 2.1×50 mm, 5 µm, póry 100, 300, 1 000, 4 000 Å.
• Mobilní fáze: A – 0,1 M triethylammonium acetát (TEAA) ve vodě; B – 0,1 M TEAA v 90 % acetonitrilu; C – 1 mg/mL roztok oligonukleotidu v A.
• Gradienty: cleanup gradient (0–4 min 100 %A→10 %B, 34 min 75 %A→25 %B, 42–48 min 0 %A→100 %B, návrat na 100 %A do 60 min) před a po DBC měření.
• Oligonukleotidy: syntetizované 25, 50, 75, 100 mer sekvence rozpuštěné na 1,0 mg/mL v mobilní fázi A.
• Měření DBC: kontinuální pumpování oligo­nukleotidového roztoku jako C až do průlomu při 25 % deflekci detektoru, korekce o mrtvý objem systému.

Hlavní výsledky a diskuse

• Pro 25mer dosáhl nejvyšší DBC materiál 100 Å díky vyšší interní ploše. S rostoucí délkou (50, 75 mer) klesá kapacita na 100 Å, protože delší řetězce nemají přístup do úzkých pórů.
• PLRP-S 300 Å poskytuje vyvážený poměr kapacity a hromadového přenosu, o čemž svědčí ostřejší průlomové křivky a užší analytické piky než u 100 Å.
• Největší póry 4 000 Å vykazovaly nejnižší DBC, ale umožňují nejrychlejší hromadový přenos a nejostřejší chromatografické píky díky neomezenému přístupu makromolekul.
• Breakthrough křivky i analytické chromatogramy potvrzují, že volba pórové velikosti je klíčová pro optimalizaci naložení a rozlišení během purifikace.

Přínosy a praktické využití metody

Výsledky usnadňují výběr stacionární fáze a odhad počátečního naložení pro purifikaci oligonukleotidů různých délek. Informace o DBC pomáhají při navrhování škálovacích experimentů i validaci procesů v QA/QC laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s ultra­výkonnou kapalinovou chromatografií (UHPLC) pro snížení doby analýzy.
• Vývoj modifikovaných polymerních materiálů s kontrolovanou porozitou a povrchovou chemii pro specifické třídy oligonukleotidů (siRNA, mRNA, aptamery).
• Automatizované platformy pro vysokoprodukční purifikaci a on-line monitoring průlomu.

Závěr

PLRP-S materiály se liší v kapacitě a kinetice vazby v závislosti na pórové velikosti. Pro krátké oligonukleotidy (do 25 mer) jsou vhodné menší póry (100 Å), pro střední délky optimální 300 Å a pro velmi dlouhé řetězce nejlépe velké póry (>1 000 Å). Správná volba stacionární fáze zlepší výtěžnost, čistotu i efektivitu purifikační metody.

Reference

1. Lloyd L. L. et al. J. Chromatogr. A 2003, 1009, 223–230.