High throughput, routine and comprehensive proteome analysis using a μPAC HPLC column based capillary-flow LC-MS workflow

Význam tématu

Proteomické studie vyžadují spolehlivou chromatografickou separaci kombinovanou s optimalizací citlivosti, reprodukovatelnosti a datové propustnosti.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit výkon μPAC HPLC kapilárních kolon v režimech vysoké propustnosti (65 vzorků/den), rutinního provozu (24 vzorků/den) a komplexní analýzy (12 vzorků/den) s použitím 2 μg trypticky štěpeného HeLa lyzátu a gradientů v rozmezí 17,5–108 min.

Použitá metodika a instrumentace

Kapilární LC-MS workflow se spojenými μPAC kolony vyráběnými mikroobráběním silikonových polí. Chromatografický systém umožňuje průtoky 1–15 μl/min (maximální tlak 350 bar). Standardní reverzní fáze, gradientní mobilní fáze: voda s 0,1 % kyseliny formiové (A) a acetonitril/voda (80/20) s 0,1 % kyseliny formiové (B). Sloupcová délka 50 cm, průměr pórů 5 µm, bez fritů.

Hlavní výsledky a diskuse

Vysoká propustnost (10 µl/min, 17,5 min gradient) dosáhla 65 vzorků/den, efektivní využití MS času 83 %, průměrná šířka PSM 3,97 s a variabilita retenčního času 0,75 s (0,12 %).
Rutinní režim (5 µl/min, 54 min gradient) umožnil 24 vzorků/den, 89 % využití MS, průměrná FWHM 8,25 s a variabilita RT 1,13 s (0,08 %).
Komplexní analýza (2 µl/min, 108 min gradient) přinesla nejvyšší kapacitu (335), 12 vzorků/den, 84 % využití MS, průměrná FWHM 11,58 s a variabilita RT 1,81 s (0,07 %).

Přínosy a praktické využití metody

• Flexibilní nastavení propustnosti a rozlišení podle požadavků.
• Vynikající reprodukovatelnost mezi kolony díky mikroobrábění.
• Nižší provozní tlak prodlužuje životnost čerpadel.
• Optimální citlivost při nižších průtocích v komplexních analýzách.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření v biomarkerových studiích a klinické proteomice.
• Škálování pro velké kohortové analýzy a QA/QC procesy.
• Integrace s pokročilými MS platformami pro hlubší krytí proteomu.
• Další optimalizace mikroobráběných stacionárních fází pro vyšší propustnost a nižší disperzi.

Závěr

μPAC HPLC kolony nabízejí vysoce reprodukovatelné a robustní řešení pro různé potřeby proteomických analýz, od rychlých skríninků až po detailní komplexní studie. Díky nízké variability retenčních časů a možnosti volby průtokových podmínek představují perspektivní nástroj pro rutinní i výzkumné workflow.

Reference

1. Scheltema RA, Hauschild JP, Lange O, et al. Mol Cell Proteom. 2014;13:3698–3708.
2. Beck S, Michalski A, Raether O, et al. Mol Cell Proteom. 2015;14:2014–2029.
3. Hopfgartner G, Bean K, Henion J, Henry R. J Chromatogr A. 1993;647(1):51–56.
4. Geyer PE, Holdt LM, Teupser D, Mann M. Mol Syst Biol. 2017;13:942–957.
5. Geyer PE, Kulak NA, Pichler G, et al. Cell Syst. 2016;2(3):185–195.
6. Geyer PE. Mol Syst Biol. 2016;12(12):901.
7. Grebe SKG, Singh RJ. Clin Biochem Rev. 2011;32(1):5–13.
8. Bruderer R, Muntel J, Müller S, et al. Mol Cell Proteom. 2019;18:1242–1254.
9. Bian Y, Zheng R, Bayer FP, et al. Nat Commun. 2020;11:157.
10. Bache N, Geyer PE, Bekker-Jensen DB, et al. Mol Cell Proteom. 2018;17(11):2284–2296.
11. Boychenko A, Pynn C, van den Berg B, et al. Thermo Fisher Tech Note. 72777.
12. Lenčo J, Vajrychová M, Pimková K, et al. Anal Chem. 2018;90(8):5381–5389.
13. De Malsche W, Gardeniers H, Desmet G. Anal Chem. 2008;80:5391–5400.
14. De Malsche W, Op de Beeck J, De Bruyne S, et al. Anal Chem. 2012;84:1214–1219.
15. Doblmann J, Dusberger F, Imre R, Hudecz O, Stanek F, Mechtler K, Dürnberger G. J Proteome Res. 2019;18(1):535–541.