Relative Quantification of TMT-labeled, cross-linked proteins using XlinkX node in Proteome Discoverer

Význam tématu

Kvanti­tativní cross-linking hmotnostní spektrometrie založená na isobarických TMT značkách a MS-štěpitelných crosslinkerech umožňuje současné určení topologie proteinových komplexů a změn jejich konformace. Tato přístupná a citlivá metoda nachází uplatnění při studiu dynamiky PP interakcí, vývoji léčiv a průmyslové QA/QC, kde je klíčové sledovat strukturální variace v biologických souborech.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vytvořit kompletní a uživatelsky přívětivý workflow v prostředí Thermo Scientific Proteome Discoverer 2.3 pro identifikaci a multiplexní kvantifikaci crosslinkovaných peptidů pomocí uzlu XlinkX 2.0. Metoda byla validována na modelových vzorcích cytochromu C a králičího 20S proteasomu za různých podmínek aktivace SDS.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific UltiMate 3000 UHPLC systém
• Thermo Scientific EASY-Spray kolona (50 cm × 75 µm)
• Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid hmotnostní spektrometr

Použitá metodika

Vzorky cytochromu C a králičího 20S proteasomu byly crosslinkovány DSSO v poměrech protein:cross-linker 1:5 a 1:100 při pokojové teplotě, následovala enzymatická digestáž a značení TMT 2-plex či 6-plex. Peptidy byly frakcionovány na SCX spin kolonkách nebo SEC, separovány RP-HPLC gradientem 2–28 % acetonitrilu a analyzovány sekvenčními akvizičními režimy ID-MS3, ID-SPS-MS3, ID-MS3-ID-SPS a SPS-MS3. Data zpracována v Proteome Discoverer 2.3 s uzlem XlinkX 2.0 a search engine SEQUEST®HT. Pro kvantifikaci byla využita korekce isotopických nečistot, ko-izolační prahová hodnota 75 % a S/N ≥ 10.

Hlavní výsledky a diskuse

Nejlepší výkonnost pro identifikaci i kvantifikaci crosslinkovaných peptidů prokázala akvizice IP-SPS-MS3 (ID-SPS-MS3). Celkem bylo identifikováno a kvantifikováno více než 100 unikátních intra- i inter-peptidových crosslinků. Validace pomocí směsí cytochromu C v definovaných poměrech (1:1, 1:5, 1:10) potvrdila linearitu a preciznost kvantifikace. U králičího 20S proteasomu aktivovaného 0,03 % a 0,1 % SDS byly detekovány konformační změny alfa podjednotky, konkrétně variace vzdálenosti Lys254–Lys199 s rostoucí koncentrací SDS.

Přínosy a praktické využití metody

Tento workflow přináší robustní a vysoce citlivé nástroje pro simultánní identifikaci i kvantifikaci crosslinkovaných proteinů. Umožňuje monitorovat dynamiku proteinových komplexů v širokém spektru aplikací: od základního výzkumu interakcí po farmaceutické a průmyslové QA/QC analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření panelu MS-štěpitelných crosslinkerů s vyšší selektivitou, automatizace celého pipeline a využití umělé inteligence pro zlepšenou interpretaci spekter. Budoucí aplikace zahrnují celoproteomické studie interaktomu a screening nových terapeutických látek.

Závěr

Byl vyvinut a otestován plně integrovaný workflow v Proteome Discoverer 2.3 s uzlem XlinkX 2.0 pro relativní kvantifikaci TMT-značených crosslinkovaných peptidů. Metoda prokázala vysokou přesnost, citlivost a uživatelskou přívětivost při studiu strukturálních změn proteinových komplexů.

Reference

• Yu C., Huszagh A., Viner R., Novitsky E.J., Rychnovsky S.D., Huang L. Developing a Multiplexed Quantitative Cross-linking Mass Spectrometry Platform for Comparative Structural Analysis of Protein Complexes. Anal Chem. 2016;88(20):10301-10308.
• Combe C.W., Fischer L., Rappsilber J. xiNET: cross-link network maps with residue resolution. Mol Cell Proteomics. 2015;14(4):1137-1147.
• Shibatani T., Ward W.F. Sodium dodecyl sulfate (SDS) activation of the 20S proteasome in rat liver. Arch Biochem Biophys. 1995;321(1):160-166.