Comparison and Optimization of First and Second Generation Quadrupole Dual Cell Linear Ion Trap Orbitrap MS for Glycopeptide Analysis

Význam tématu

Analýza intact glykopeptidů představuje klíčový krok ve výzkumu posttranslačních modifikací proteinů a glykoproteomiky. Přesné určení sekvence peptidového páteře i lokalizace glykonosné vazby zlepšuje porozumění biologické funkci glykoproteinů a potenciálně otevírá cestu k novým biomarkerům onemocnění.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie porovnává a optimalizuje parametry prvové (Orbitrap Fusion MS) a druhové generace (Orbitrap Fusion Lumos MS) kvadrupól-duálního lineárního iontového trapu s Orbitrap detektorem pro analýzu intact glykopeptidů. Cílem bylo maximalizovat identifikaci glykosylovaných peptidů pomocí elektrondonorově přenosové disociace (ETD) a varianty EThcD.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky glykopeptidů byly obohaceny pomocí silně aniontové výměnné chromatografie (SAX) z lidského séra a lyzátů HeLa buněk. Kapalinová chromatografie probíhala na systému Thermo Scientific EASY-nLC 1000 s kolonkou C18 PepMap (75 µm × 50 cm, 2 µm, 100 Å). Fragmentace probíhala na přístrojích:

• Orbitrap Fusion MS (první generace)
• Orbitrap Fusion Lumos MS (druhá generace)

Různé parametry ETD, včetně doby reakce, AGC target hodnot, izolačních šířek a doplňující aktivační kolizní energie (20–25 %), byly testovány s využitím HCD-pd-ETD a HCD-pd-EThcD workflow. Analýza dat byla prováděna softwarem Byonic™.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace odhalila následující klíčové poznatky:

• Druhá generace Orbitrap Fusion Lumos MS při ETD identifikovala o 9 % více unikátních glykopeptidů než Fusion MS.
• Při EThcD bylo u Lumos MS dosaženo o 43 % vyššího počtu unikátních glykopeptidů oproti Fusion MS.
• Porovnání EThcD s ETD na Lumos MS ukázalo o 49 % více identifikací glykopeptidů při použití EThcD.
• Delší ETD reakční časy vedou k lepší kvalitě spekter intact glykopeptidů.
• Optimální doplňující kolizní energie pro EThcD byla v rozmezí 20–25 %.
• HCD v Tribrid systému poskytuje kvalitní fragmenty b/y iontů, avšak pro lokalizaci glykosylace je stále výhodnější EThcD.

Přínosy a praktické využití metody

Tato optimalizace umožňuje vyšší spolehlivost při lokalizaci glykosylovaných míst a rozlišení izobarických glykoizomerů. Výsledky mají praktické využití pro rozsáhlé glykoproteomické studie v biomedicínském výzkumu, včetně objevování biomarkerů rakoviny a hodnocení glykoform v kvalitativní a kvantitativní kontrole.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace technik datově nezávislého sběru (DIA), vylepšené algoritmy pro identifikaci glykopeptidů v reálném čase a rozšíření platformy o nové typy disociačních metod. Kombinace s iontově mobilní separací a vysokorychlostními MS přístroji slibuje další nárůst citlivosti a průchodnosti analýz.

Závěr

Orbitrap Fusion Lumos MS v kombinaci s EThcD přináší výrazné zvýšení počtu a kvality identifikací intact glykopeptidů oproti předcházejícímu systému. Doporučené parametry (delší ETD časy, 20–25 % doplňující CE) a použití EThcD posouvají hranice glykoproteomické analýzy.

Reference

1. Saba J. et al. Comparison and Optimization of First and Second Generation Quadrupole Dual Cell Linear Ion Trap Orbitrap MS for Glycopeptide Analysis. Thermo Fisher Scientific. 2016.