High-throughput quantitative metabolomics utilizing high-resolution accurate mass measurements

Význam tématu

V potravinářské a výzkumné praxi je schopnost rychle a spolehlivě kvantifikovat klíčové metabolity v mléčných produktech zásadní pro sledování kvality, autenticity a bezpečnosti potravin. Vysoce přesná analýza aminokyselin a organických kyselin umožňuje odlišit zdroj mléka (bovinní vs. rostlinné), typ výroby (organické vs. konvenční) a obsah tuku. Cílená metabolomika tak přispívá k ochraně spotřebitele a boji proti podvodům v potravinářském řetězci.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem autoři navrhli pětiminutovou vysoce propustnou LC-MS metodu k robustní kvantifikaci vybraných aminokyselin (alanin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, valin) a organických kyselin (maleinová, jantarová, glukonová, 2-hydroxyglutarová, kyselejší, orotová, hippurová) v různých typech mléka. Metoda má sloužit jako screeningový nástroj pro rutinní rozlišení mezi druhy mléka a sledování výroby.

Použitá metodika a instrumentace

Pro extrakci metabolitů autoři upravili Folchův protokol: chloroform–metanol (2:1) extrakce s vnitřními standardy, suchá extrakce a resuspense ve 5 % MeOH.
Liquid chromatography: Vanquish Horizon UHPLC systém, kolona Hypersil GOLD C18 (2,1×150 mm, 1,9 µm), teplota 55 °C, objem injekce 2 µL, gradient 0–5 min, průtok 0,45 mL/min.
Mass spectrometry: Orbitrap Exploris 240 s vysokým rozlišením (120 000), ESI(+) pro aminokyseliny a ESI(–) pro organické kyseliny, scan 70–800 m/z, Easy-IC interní kalibrace, parametry: spray 3,5/3,0 kV, vaporizer 320 °C, transfer tube 275 °C.
Software: Xcalibur pro akvizici dat, TraceFinder 5.1 pro kvantifikaci s tolerancí 3 ppm.

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrační křivky pro všechny analyty vykázaly lineární fit R2>0,99, CV calibration ≤10 %. Reprodukovatelnost retence, ploch a přesnosti hmotnosti v QCs v mezích CV≤0,5 %.
Aminokyseliny: bovinní mléko s vyšším obsahem tuku mělo nižší koncentrace než rostlinná alternativní mléka; sojové mléko obsahovalo až 20× více fenylalaninu než bovinní.
Organické kyseliny: hippurová a orotová kyselina spolehlivě označují bovinní mléko; glukonová kyselina je markerem sójového mléka. Maleinová a glukonová kyselina byly zvýšené v nízkotučných a redukovaně tučných vzorcích, malátová a jantarová kyselina odlišovaly organické a neorganické vzorky.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé rutinní rozlišení zdroje mléka (bovinní vs. rostlinné).
• Sledování výrobních podmínek (organické vs. konvenční, úroveň tuku).
• Podpora kvality a autentifikace v potravinářských laboratořích a QA/QC.
• Modulární přístup kombinující cílenou a netargetovanou metabolomiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu metabolitů o další nutriční a senzorické markery.
• Automatizace přípravy vzorků a integrace s robotickými systémy.
• Využití strojového učení pro predikci původu a kvality mléka z datových vzorců.
• Implementace v on-site a online monitoringu mlékárenských procesů.

Závěr

Autoři úspěšně vyvinuli vysoce propustnou a robustní LC-MS metodiku pro cílenou kvantifikaci klíčových aminokyselin a organických kyselin v různých typech mléčných výrobků. Metoda prokázala vynikající linearitu, opakovatelnost a schopnost diferencovat zdroj a kvalitu mléka, což přináší nový nástroj pro potravinářskou analytiku.

Reference

• Amer B., Deshpande R.R., Hermanson D., Bird S., Hühmer A. High-throughput quantitative metabolomics utilizing high-resolution accurate mass measurements, Thermo Fisher Scientific, 2021.