COMPARISON OF PRODUCT ION SPECIFICITY IN LC-MS DATA INDEPENDENT ACQUISITION (DIA) BETWEEN MSE AND MSE WITH M/Z SELECTIVE INTENSITY ENCODING

Význam tématu

Data nezávislé akvizice (DIA) v LC–MS zajišťují komplexní pohled na fragmentační spektra v proteomice a dalších oblastech. Tradiční přístup MSE umožňuje získat MS/MS informace pro všechny prekurzory, avšak při rostoucí složitosti vzorku klesá jednoznačnost přiřazení fragmentů k prekurzorům a zhoršuje se kvantitativní dynamický rozsah. Zavedení selektivního kódování intenzity podle m/z pomocí skenovacího notche slibuje zvýšení specificity bez zásadního úbytku citlivosti.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo porovnat klasické MSE se zpracováním dat nezávislé akvizice s novým přístupem m/z selektivního kódování intenzity. Studie hodnotí vliv kódování na redukci šumu, zlepšení signál-šum, kvalitu extrahovaných chromatogramů a výsledky databankového vyhledávání u komplexního proteolytického digestu Escherichia coli.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek tvořil standardní tryptický digest E. coli. Chromatografická separace probíhala na systému nanoACQUITY UPLC s analytickou kolonou CSH 300 µm × 10 cm při gradientu 5–40 % acetonitrilu s 0,1 % kyseliny mravenčí v průběhu 45 minut, průtok 7 µl/min. Detekce v režimu MSE probíhala při nízké a vysoké energii kolizí, doplněno kódováním prekurzorů pomocí dipólové excitace ve škálovacím kvadrupólu. Akvizice skenovacím notch vzorem zajišťovala postupné odstraňování pěti rozsahů m/z v rozmezí 300–1100, který byl během 0,5 s opakován pětkrát. Dekódování dat využívalo nenegativní nejmenší čtverce pro rekonstrukci trojrozměrné matice (retence, prekurzor m/z, fragment m/z). Chromatogramy a spektra byla extrahována z dekódovaných dat, následně kombinována a prahována pro eliminaci pozadí.

Hlavní výsledky a diskuse

• Extrahované iontové chromatogramy z dekódovaných dat vykazovaly výrazně snížené pozadí a lepší poměr signál–šum při zachování hlavních fragmentů.
• Filtrace podle kódování vedla ke zjednodušení spekter a zvýšila počet identifikovaných proteinů o 33 % oproti nefiltravaným datům.
• Počet unikátních peptidových sekvencí nad prahovou hodnotou vzrostl o více než 40 % a zápisné skóre peptidů se zlepšilo u více než tří čtvrtin společných peptidů.
• Citlivost zůstala na vysoké úrovni, přičemž pouze asi čtvrtina iontů byla při filtraci deaktivována.
• Výsledky ukazují, že kódování prekurzorů zvyšuje příbuznost fragmentů s původními prekurzory a čistotu dat ve složitých vzorcích.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje získat čistší fragmentační spektra, zlepšuje spolehlivost databankového vyhledávání a kvantitativní analýzu díky nižšímu pozadí a vyššímu poměru signál–šum. Laboratoře QA/QC i výzkumná centra v proteomice tak mohou dosáhnout většího pokrytí proteinů a přesnější kvantifikace při obdobných instrumentálních nákladech.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj real-time dekódování s využitím GPU akcelerace pro zpracování v reálném čase.
• Optimalizace kombinace dat z různých energií kolizí pro rozšíření dynamického rozsahu.
• Pokročilá dekonvoluce s vyšším rozlišením pro ještě detailnější mapování fragmentů.
• Aplikace v cílené proteomice a farmaceutické analýze, kde je klíčová vysoká specificita a kvalita kvantifikace.

Závěr

Implementace m/z selektivního kódování intenzity ve formě skenovacího notch vzoru významně zlepšuje specificitu MSE dat u složitých vzorků. Získaná redukce šumu, zvýšený počet identifikací proteinů a peptidů a minimální úbytek citlivosti podtrhují praktický přínos metody pro rozšířenou analýzu v proteomice i jiných oblastech analytické chemie.

Reference

• Waters Corporation: Proc. ASMS 2020
• Matrix Science Ltd: Mascot MS/MS ion search