Determination of Hydrodynamic Radius With MaxPeak Premier Protein SEC Columns

Význam tématu

Size exclusion chromatography (SEC) umožňuje stanovení hydrodynamického poloměru (Rh) biomolekul v roztoku, což je klíčové pro sledování konformace proteinů, jejich interakcí a stability při vývoji formulací biologických léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo separovat proteiny s různými známými Rh na kolonách Waters XBridge a ACQUITY Premier Protein SEC 250 Å, vytvořit kalibrační křivky Log(Rh) vs. retenční čas a aplikovat je na měření Rh monoklonální protilátky trastuzumabu. Studie také porovnala vliv iontické síly mobilní fáze.

Použitá metodika a instrumentace

• LC systém ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio
• Detektor ACQUITY UPLC TUV při 280 nm
• Kolonky XBridge Premier Protein SEC 250 Å, 2,5 µm (7,8 × 300 mm) a ACQUITY Premier Protein SEC 250 Å, 1,7 µm (4,6 × 300 mm)
• Mobilní fáze: DPBS (1X, 1,5X a 2X), filtrace 0,1 µm
• Kolona ambient, vzorek 10 °C
• Objemy injekcí a průtoky upravené dle průměru kolony
• Software Empower 3

Hlavní výsledky a diskuse

• Kalibrace Log(Rh) vs. retenční čas vykazovala vynikající linearitu (R²>0,995) pro obě kolony.
• Změna iontické síly mobilní fáze (1X–2X DPBS) neovlivnila významně parametry kalibrace.
• Stanovené Rh trastuzumabu se liší o méně než 6 % oproti literatuře (DLS).
• Kalibrace na molekulární hmotnost (MW) poskytla nižší linearitu (R²>0,988) a vyšší odchylku (>22 %), což odráží omezení SEC při odhadu MW bez zohlednění konformace.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a přesné stanovení Rh proteinů v biologicky relevantních podmínkách.
• Možnost sledovat konformační změny a interakce proteinů při vývoji léčiv.
• Minimální sekundární interakce díky povrchovým úpravám MaxPeak Premier HPS a BEH SEC částic.
• Vhodné pro QA/QC a výzkumné laboratoře zaměřené na proteinovou analytiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření kalibrace na další třídy biomolekul, polysacharidy nebo komplexní proteiny.
• Integrace SEC s MALS, MS nebo jinými detekčními technikami pro komplexní charakterizaci.
• Automatizace workflow a propojení s laboratorními informačními systémy.
• Použití při stabilnostních studiích a finální formulaci bioterapeutik.

Závěr

SEC s kolonkami Waters MaxPeak Premier umožňuje spolehlivé stanovení hydrodynamického poloměru proteinů a minimalizuje sekundární interakce. Kalibrace na Rh je přesnější než klasická MW kalibrace a poskytuje relevantní data pro vývoj a kontrolu kvality proteinových léčiv.

Reference

1. Wilkins D. K. et al. Hydrodynamic Radii of Native and Denatured Proteins Measured by Pulse Field Gradient NMR Techniques. Biochemistry 1999;38(50):16424–16431.
2. Verde V. L. et al. Determination of Hydrodynamic Radius of Proteins by Size Exclusion Chromatography. Bio-protocol 2017;7(08).
3. Ramos J. et al. Hydrodynamic and Electrophoretic Properties of Trastuzumab/HER2 Complexes. Int. J. Mol. Sci. 2019;20:1076.