Purification of Single-Stranded RNA Oligonucleotides Using High‑Performance Liquid Chromatography

Význam tématu

Oligonukleotidy se staly klíčovými nástroji v biochemickém výzkumu a farmaceutické výrobě díky své schopnosti cílené interakce s biomolekulami. Pro dosažení terapeutické účinnosti je nutné odstranit velmi podobné vedlejší produkty, které vznikají při syntéze, a to i u vysoké účinnosti reakcí. Ion-pair reverzní fázová HPLC poskytuje potřebné rozlišení a reprodukovatelnost pro purifikaci krátkých RNA řetězců.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout a optimalizovat analytickou metodu pro separaci jediného řetězce RNA oligonukleotidu poté převést podmínky na preparativní měřítko. Experimenty byly navrženy tak, aby prokázaly škálovatelnost použitím stejných chemických podmínek a stacionární fáze v analytickém i preparativním režimu.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala dvě fáze:

• Vývoj analytické metody na systému Agilent 1260 Infinity II (binární pumpa, vialsampler, DAD detector, multicolumn termostat) s kolonou PLRP-S 4,6×150 mm, 8 µm.
• Transfer na preparativní soustavu Agilent 1290 Infinity II Preparative LC (preparativní binární pumpa, autosampler/fraction collector, UV detektor) s kolonou PLRP-S 25×150 mm, 8 µm.

Mobilní fáze A: 0,1 M hexylammonium acetát, pH 7,0 s 10 % urey; B: acetonitril. Shallow gradient od ~32 % do 100 % B. Frakční sběr založen na UV prahu a časových úsecích 9 s.

Hlavní výsledky a diskuse

Analytické separace při 2 mg/mL ukázaly ostré špičky a vhodný gradient. Na preparativním systému bylo injikováno 20 mg vzorku, z čehož se pomocí frakčního sběru získalo 11 dílčích frakcí. Reanalýza při 80 °C potvrdila, že střední frakce dosahují nejvyšší čistoty. Sestavením poolingového diagramu bylo zjištěno, že frakce 3–7 lze sloučit a získat produkt s čistotou >99 % a výtěžkem 56,3 %.

Přínosy a praktické využití metody

Prezentované workflow nabízí:

• Vysokou čistotu >99 % při rozumné výtěžnosti.
• Reprodukovatelné škálování od analytického k preparativnímu měřítku.
• Flexibilní frakční sběr umožňující cílené sloučení frakcí podle požadované čistoty a výtěžku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování může zahrnovat automatizaci frakčního sběru a poolingových strategií, integraci MS detekce pro rychlou identifikaci kontaminantů, vývoj nových ion-párových činidel pro ještě lepší rozlišení a širší spektrum aplikací v genové terapii a CRISPR technologiích.

Závěr

Použití Agilent PLRP-S kolon a 1290 Infinity II Preparative LC umožnilo efektivní purifikaci 22mer RNA oligonukleotidu s vysokou čistotou a dobrým výtěžkem. Popisované podmínky a postupy demonstrují spolehlivou škálovatelnost a snadnou adaptaci v průmyslové i výzkumné praxi.

Reference

• Roberts T. C.; Langer R.; Wood M. J. A. Advances in Oligonucleotide Drug Delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 2020, 19, 673–694.
• Fueangfung S.; Yuan Y.; Fang S. Denaturing Reversed-Phase HPLC Using a Mobile Phase Containing Urea for Oligodeoxynucleotide Analysis. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 2014, 33(7), 481–488.
• Guillarme D. et al. Method Transfer for Fast Liquid Chromatography in Pharmaceutical Analysis: Application to Short Columns Packed with Small Particle. Part II: Gradient Experiments. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2008, 68(2), 430–440.