Online Amino Acid Analysis for Spend Media Control

Význam tématu

Kontinuální monitoring obsahu aminokyselin v živném médiu je klíčový pro stabilní a reprodukovatelnou výrobu biotechnologických produktů, zejména monoklonálních protilátek. Správná úroveň glutaminu zajišťuje optimální růst buněk a vysoké výtěžky cílových molekul.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ukázat schopnost Agilent InfinityLab Online LC Solution detekovat a kvantifikovat hladiny aminokyselin v Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) během 48hodinového experimentu. Systém automaticky odebírá vzorky po 5 hodinách, provádí derivatizaci a chromatografické měření, a data poskytuje v reálném čase.

Použitá metodika

Vzorky buněčného média jsou automaticky derivatizovány precolumn metodou: primární aminokyseliny pomocí OPA a sekundární pomocí Fmoc. Po přípravě vzorku se analyty separují na reverse-phase kolóně AdvanceBio AAA a detekují diode array detektorem. Metoda využívá gradientní eluci (0–57 % organiky v 13,4 min) při průtoku 0,6 mL/min, s následnými fázemi sleep a wake-up pro úsporu mobilní fáze.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II High Speed Pump (G7120A)
• Agilent 1260 Infinity II Online Sample Manager Set (G3167AA) s externím ventilem
• Agilent 1290 Infinity II Multicolumn Thermostat (G7116B)
• Agilent 1260 Infinity II Isocratic Pump (G7110B)
• Agilent 1260 Infinity II High Performance Degasser (G4225A)
• Agilent 1290 Infinity II Diode Array Detector (G7117B) s Max-Light Cartridge Cell
• AdvanceBio AAA LC kolóna a guard kolóna, 3,0 × 100 mm, 2,7 μm
• Software: Agilent OpenLab CDS 2.6 a Online LC Monitoring Software 1.0

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila přesné stanovení glutaminu v DMEM obohaceném na 4,5 mM. Průměrná naměřená hodnota byla 4 635 pmol/μL (4,635 mM) s RSD 2,3 %. Retenční čas glutaminu byl stabilní v průměru 3,887 min (RSD 0,16 %). Kvalita měření byla ověřena řízeným QC solí norvalinou (500 pmol/μL), s koncentrací RSD 0,56 % a retenčním časem RSD 0,06 %. Použití sleep/wake-up režimu snížilo spotřebu rozpouštědla a umožnilo nepřetržitý provoz několik dní bez obsluhy.

Přínosy a praktické využití metody

Díky plně automatizovanému odběru, derivatizaci a chromatografii lze vést procesy buněčné kultivace v téměř reálném čase. Uživatelé mohou okamžitě upravovat přídavky glutaminu, což zvyšuje efektivitu a spolehlivost bioprodukce. Metoda minimalizuje riziko kontaminace a pracovní čas obsluhy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření online LC analýzy o další metabolity a biomolekuly pro komplexní PAT (Process Analytical Technology). Integrace s automatizovanými řídicími systémy pro uzavřenou smyčku dávkování živin. Využití strojového učení pro predikci trendů a optimalizaci výsledků. Miniaturizace a optimalizace spotřeby reagencií pro udržitelnější analýzy.

Závěr

Agilent InfinityLab Online LC Solution prokázala spolehlivé a přesné stanovení aminokyselin ve spen-d médiu během dvoudenního experimentu. Díky plné automatizaci, robustní chromatografii a softwarové integraci lze tento přístup efektivně využít v biotechnologických výrobách ke kontinuálnímu řízení kvality kultivačního média.

Reference

1. Amino Acid Analysis How-To Guide, Agilent Technologies, publication number 5991-7694EN, 2021.