Analysis of Amino Acids in Spent Media Using Automated Precolumn Derivatization with the Agilent 1290 Infinity II Bio LC System

Význam tématu

Analýza aminokyselin ve spent media je klíčová pro sledování výživných látek v kultivacích buněk a optimalizaci bioprocesů. Umožňuje včas detekovat pokles esenciálních aminokyselin a rozhodovat o výměně média či doplňcích substrátů.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie popisuje kvantitativní metodu pro sledování změn koncentrací 20 aminokyselin ve spent media během kultivace buněk HeLa a HepG2 v DMEM. Použit byl Agilent 1290 Infinity II Bio LC systém s automatizovanou precolumn derivatizací (OPA/FMOC) a dvojitou detekcí DAD a FLD. Dále je demonstrována zkrácená UHPLC metoda pro rychlou analýzu.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace:
  • Agilent 1290 Infinity II Bio vysokorychlostní pumpa
  • Agilent 1290 Infinity II Bio multisampler s programem derivatizace
  • Agilent 1290 Infinity II multicolumn termostat
  • Agilent 1290 Infinity II diode array detektor (DAD)
  • Agilent 1260 Infinity II fluorescenční detektor (FLD) a speciální flow cely
• Derivatizace: precolumn derivatizace OPA pro primární a FMOC pro sekundární aminokyseliny s automatickým mícháním a inkubací v injektoru
• Chromatografie:
  • Kolona AdvanceBio AAA (3,0×100 mm, 2,7 µm) s guard kolonkou
  • Mobilní fáze A: 10 mM Na₂HPO₄/Na₂B₄O₇ pH 8,2; B: acetonitril/methanol/voda (45:45:10)
  • Gradientní eluce: standardní 17 min (0,6 mL/min), rychlá 11 min (1,2 mL/min)
  • Detekce: DAD (338 nm/390 nm), FLD (345 nm/455 nm a 265 nm/315 nm) s PMT gain 10
  • Vzorky: 10× ředění spent media, přídavek interních standardů (norvalin, sarcin)

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda dosahuje vysoké citlivosti a reprodukovatelnosti; FLD poskytuje lepší odezvu než DAD kromě cystinu, který je kvantifikován z DAD signálu.
• Ve spent media se během růstu buněk prokazatelně spotřebovávají glutamin, serin, arginin a tyrosin, zatímco glycin a alanin se akumulují jako vedlejší produkty metabolismu.
• Zrychlená UHPLC metoda udržuje srovnatelnou kvalitu separace za pouhých osm minut, čímž zkracuje celkový čas analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimalizace manuálních přípravných kroků, snížení rizika chyb operátora a zvýšení throughputu laboratoře.
• Průběžné monitorování klíčových živin umožňuje rychlá rozhodnutí o doplňování média a optimalizaci podmínek kultivace.
• Metoda je využitelná pro QA/QC v biotechnologických provozech, výzkumu biologických léčiv a bioprocesním vývoji.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace online monitorovacích modulů přímo v bioreaktorech pro kontinuální řízení bioprocesu.
• Rozšíření analytiky o další metabolity, vitamíny a biopolymery pro komplexní profilování kultivačního prostředí.
• Využití Big Data a strojového učení pro prediktivní modelování a adaptivní optimalizaci bioprocesů.

Závěr

Automatizovaná precolumn derivatizace na Agilent 1290 Infinity II Bio LC systémě umožňuje spolehlivou, citlivou a rychlou kvantifikaci aminokyselin ve spent media. Metoda podporuje efektivní monitorování bioprocesů a optimalizaci kultivačních podmínek.

Reference

1. Yao T., Asayama Y. Animal‐Cell Culture Media: History, Characteristics, and Current Issues. RMB 2017.
2. Segeritz C. P., Vallier L. Cell Culture: Growing Cells as Model Systems In Vitro. Academic Press 2017.
3. Salazar A., Keusgen M., von Hagen J. Amino Acids in the Cultivation of Mammalian Cells. J. Amino Acids 2016.
4. Wu G. Functional Amino Acids in Growth, Reproduction, and Health. Adv. Nutr. 2010.
5. Zhou T., Reji R., Kairon R. S., Chiam K. H. Review of Algorithmic Approaches for Cell Culture Media Optimization. Front. Bioeng. Biotechnol. 2023.
6. Agilent Technologies. Online Amino Acid Analysis for Spent Media Control. Application Note 5994-4931EN, 2022.
7. Agilent Technologies. Comparison of Plant-Based Meat Alternatives and Meat. Application Note 5994-5950EN, 2023.
8. Lee K. S., Drescher D. G. Derivatization of Cysteine and Cystine for Fluorescence Amino Acid Analysis With the o-Phthaldialdehyde/2-mercaptoethanol Reagent. JBC 1979.
9. Hosios A. M. et al. Amino Acids Rather Than Glucose Account for the Majority of Cell Mass in Proliferating Mammalian Cells. Dev. Cell 2016.
10. DeBerardinis R. J. et al. Beyond Aerobic Glycolysis: Transformed Cells Can Engage in Glutamine Metabolism That Exceeds the Requirement for Protein and Nucleotide Synthesis. PNAS 2007.
11. Lukey M. J., Katt W. P., Cerione R. A. Targeting Amino Acid Metabolism for Cancer Therapy. Drug Discov. Today 2017.
12. da Silva M. R. et al. A Rapid, Simple, and Sensitive Microfluidic Chip Electrophoresis Mass Spectrometry Method for Monitoring Amino Acids in Cell Culture Media. J. Chromatogr. A 2021.