PepMap C18 Columns for Reversed-Phase Chromatography of Peptides

Význam tématu

Přesná a reprodukovatelná separace peptidů je klíčová v proteomice, farmaceutickém vývoji a bioanalytické QC. Reverzní fázová chromatografie na C18 kolonách umožňuje rozlišení komplexních směsí na základě hydrofobních interakcí a poskytuje vysoké rozlišení i při analýzách náročných vzorků.

Cíle a přehled dokumentu

Tento dokument popisuje konstrukci, vlastnosti a provozní postupy PepMap C18 kolony určené pro reverzní fázovou chromatografii peptidů. Obsahuje doporučení pro přípravu kolony, mobilní fáze, vzorků, metodiku regenerace a standardní testovací protokoly.

Použitá metodika a instrumentace

Použitá instrumentace:

• Kolony PepMap C18 (5 µm, 300 Å, end-kapped C18 na silice)
• HPLC soustava vybavená UV detektorem na 215 nm
• EZ™ Grip nerezové přípojky
• PEEK tubing (0,005" ID pro 2,1 mmD, 0,010" ID pro 4,6 mmD kolony)
• Degasační jednotka nebo helium pro odplynění mobilní fáze

Metodika:

1. Před prvním použitím propláchnout kolonou 5 objemů acetonitrilu a poté 5 objemů výchozí mobilní fáze.
2. Příprava mobilní fáze podle doporučených podmínek (0,1 % TFA ve vodě vs. 95 % ACN + 0,1 % TFA).
3. Naložení vzorku: filtrace na 0,22–0,45 µm a ředění do výchozí fáze.
4. Separace gradientem 0–50 % organické fáze za 40 minut při průtoku 1,0 ml/min (4,6 mmD/250 mmL).
5. Regenerace kolony: rychlé gradienty mezi silným solubilizátorem (50 % kyselina octová/guanidin) a silným elučním činidlem (ACN nebo isopropanol), event. vícenásobné injekce.

Hlavní výsledky a diskuse

Standardní testovací směs pěti peptidů (Gly-Tyr, Val-Tyr-Val, Met-Enkephalin, Leu-Enkephalin, Angiotensin II) umožňuje reprodukovatelnou separaci s ostrými vrcholy a vysokou účinností. Počet teoretických destiček splňuje specifikace výrobce a zajišťuje vysoké rozlišení složek. Kolona vykazuje dobrou chemickou odolnost v rozsahu pH 2–7 (krátkodobě 7–9) a stálý tlakový pokles do 350 bar.

Přínosy a praktické využití metody

Reverzní fázová chromatografie na PepMap C18 kolónách:

• Umožňuje efektivní analýzu a kvantifikaci peptidů a malých proteinů
• Podporuje vysoce reprodukovatelná měření pro QC farmaceutických produktů
• Je ideální pro proteomické workflow spojené s MS detekcí
• Poskytuje robustní výkon při náročných biochemických vzorcích

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje:

• Zkrácení doby analýzy použitím ultra­vysokotlakých (UHPLC) systémů
• Optimalizace povrchových chemických modifikací pro širší rozsah pH
• Miniaturizace kolony pro nanoLC-MSn aplikace
• Integrace s automatizovanými vzorkovači a online regenerací

Závěr

PepMap C18 kolony představují spolehlivé a výkonné řešení pro reverzní fázovou chromatografii peptidů. Díky optimalizovanému sorbentu, kapsulaci silanolů a doporučeným pracovním postupům je dosaženo vysoké účinnosti, reprodukovatelnosti a dlouhodobé stability.

Reference

• PerSeptive Biosystems. Operating Instructions PepMap C18™ Columns for Reversed-Phase Chromatography of Peptides.
• Sigma Chemical Co. Catalog # H-2016, Peptide Test Standard.