Peptide and protein analysis by capillary HPLC – Optimization of chromatographic and instrument parameters

Význam tématu

Peptidová a proteinová analýza je klíčová pro biochemii, proteomiku a farmaceutický výzkum. Kapilární HPLC nabízí vysokou citlivost i při nízkém objemu vzorku, což je zásadní pro analýzu nízkokoncentrovaných biomolekul.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřuje na optimalizaci chromatografických a instrumentálních parametrů při kapilární HPLC analýze biologicky aktivních peptidů, proteinů a trávných směsí. Cílem je dosáhnout vysoké reprodukce retencí (< 0,5 % RSD) a kvalitního rozlišení komplexních vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

• Kapilární HPLC systém Agilent 1100 (konfigurovaný jako kapilární Agilent 1200 Series)
• Mikrovakuový odplynovač (1 ml), vysokotlaká kapilární pumpa s elektronickou regulací průtoku (EFC)
• Autosampler pro objemy 0,01–8 µl s chlazením
• Termostatovaná kolona (10 °C pod okolní teplotou až do 80 °C)
• Diodový array detektor s 500 nl kyvetou
• Kapilární kolony Zorbax C-18 a C-8 (póry 80 a 300 Å, SB a Extend) a Hypersil ODS C-18
• Vzorky: standardní peptidy (Met-Enkephalin, Leu-Enkephalin, Angiotensin I/II aj.) a proteiny (cytochrom c, myoglobin, transferrin, lysozym, ribonukleáza)

Hlavní výsledky a diskuse

• Kolony s póry 300 Å (Extend C-18) poskytují kratší retence a symetričtější špičky jak u peptidů, tak u proteinů.
• Snížení koncentrace TFA zlepšilo rozlišení nízkomolekulárních peptidů; pro MS detekci je vhodnější 0,1 % formiová kyselina.
• Shallow gradienty (0,25 % B/min) vedly k lepšímu rozlišení peptidových map.
• Zvýšení teploty kolony (až na 60 °C) zkrátilo doběh analýzy a zlepšilo separaci prvních špiček.
• Silné změny pH výrazně ovlivnily eluci peptidů s ionizovatelnými zbytky.
• Opakované injekce proteinů stabilizovaly retence pod 0,5 % RSD po cca 5 vstreknutích.
• Automatická redukce zpoždění injektoru minimalizovala disperzi při nízkých průtocích (≈5,5 µl/min).

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoce reprodukovatelná platforma pro potvrzování identity špiček retencí a MS daty.
• Úspora vzorku i reagencií díky průtoku 5–6 µl/min a objemu injekce 0,1–3 µl.
• Vhodná pro široké spektrum aplikací: izolace peptidů, analýzu proteinů a enzymatických diges­tů.
• Možnost kombinace UV a MS detekce pro komplexní proteomické strategie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj kolónových materiálů s optimalizovanými póry a povrchovými úpravami pro posttranslační modifikace.
• Integrace rychlých gradientů a online MS/MS pro vysokokapacitní proteomiku.
• Automatizace mikrolab-on-chip platforem s ultra-nízkým objemem.
• Pokročilé datové analýzy a umělá inteligence pro interpretaci komplexních chromatogramů.

Závěr

Kapilární HPLC s optimalizovanými kolonovými materiály, gradienty, modifikátory a instrumentálními nastaveními nabízí robustní a citlivou metodu pro analýzu peptidů a proteinů s retencemi reproducibilními pod 0,5 % RSD a vysokou separační účinností.

Reference

1. Chromatography and Spectroscopy Supplies, Reference Guide, Agilent 5988-4785EN (2002).
2. J.Rivier, R.McClintock, Reversed-phase HPLC of insulins, J.Chrom. 268, 112–119 (1983).
3. X.Geng, F.E.Regnier, Retention model for proteins in reversed-phase LC, J.Chrom. 296, 15–30 (1984).
4. Agilent Technical Note 5988-7511EN, Performance of 1100 Series capillary HPLC with DAD and MS (2002).