Exploring Depth and Breadth of a Protein Complex Mixture with Top-Down Data-Independent Acquisition Using an Orbitrap Fusion Tribrid Mass Spectrometer

Význam tématu

Top-down proteomika představuje klíčový přístup pro identifikaci intactních proteinů v komplexních směsích a současné sledování rozmanitosti proteoform. Ve srovnání s bottom-up metodami dokáže poskytnout přímé informace o různých modifikacích, splice formách a heterogenitě bílkovin. Hlavní výzvou je však široké rozložení nábojových stavů intactních proteinů, které snižuje citlivost a selektivitu při výběru prekurzorů pro MS2.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo porovnat čtyři varianty top-down workflow na Orbitrap Fusion Tribrid instrumentu: MS1 akvizice v Orbitrapu (R=240 000) vs. v ion trapu (nízké rozlišení, vysoká citlivost) a MS2 akvizice data-dependent (DDA) vs. data-independent (DIA) s širokými izolačními okny (100–250 m/z). Pro testování dynamického rozsahu a proteoformální rozlišení byl použit UPS2 standard obsahující 48 intactních proteinů v koncentracích od 0,05 do 5000 fmol na injekci.

Použitá metodika a instrumentace

Protokol zahrnoval:

• Vzorek: 1 µg UPS2 Dynamic Range (Sigma) rekonstituovaný v 10 % acetonitrilu s 0,1 % TFA.
• Kapalinová chromatografie: EASY-Spray™ Pepswift monolitický 200 µm × 25 cm kolonka, gradient 10–60 % acetonitrilu/0,1 % kyseliny mravenčí, průtok 4 µl/min, 60 min.
• MS1 akvizice: Orbitrap (R=240 000, AGC 2e5, 2 scans) vs. ion trap (AGC 5e4, 10 ms scans).
• MS2 akvizice: DDA (izolace 5 m/z, HCD 20 % CE, Orbitrap R=240 000 nebo ion trap) vs. DIA (izolační šířky 100/250 m/z, HCD 20 % CE).
• Analýza dat: ProSightPD node v Proteome Discoverer 2.0 s dekonvolucí ReSpect (IT-MS1) a Xtract (OT-MS1) a vyhledáváním AbsoluteMass.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání akvizičních režimů odhalilo komplementární vlastnosti:

• IT-MS1 + DDA: vysoká citlivost na malé proteiny, ale omezená schopnost rozhodovat o nábojových stavech vedla k identifikaci pouze vysoce koncentrovaných bílkovin.
• IT-MS1 + DIA: rozšíření detekovatelného rozsahu o ~2 řády pro malé proteiny a 2–fold zlepšení kvality MS2 (−Log E-Value).
• OT-MS1 + DDA: excelentní rozlišení a detekce nízkých hladin (např. IGF II při 5 fmol), ale střední proteiny byly méně zdokumentovány.
• OT-MS1 + DIA: navýšení počtu detekovaných středních proteinů (např. Hemoglobin α/β), ale u velkých proteinů (serum albumin 66 kDa) bez významného zlepšení oproti DDA.
• Celkem bylo detekováno >160 proteoform z 13 skupin proteinů v rozsahu 3 řádů koncentrací.

Přínosy a praktické využití metody

Výsledky ukazují, že volba MS1 detektoru a způsobu MS2 akvizice lze flexibilně přizpůsobit cíli analýzy:

• Pro screening nízkomolekulárních proteinů v nízkých koncentracích je vhodný OT-MS1 + DDA.
• Pro rozšíření dynamického rozsahu a zvýšení počtu detekovaných proteoform je atraktivní DIA přístup s ion trap MS1.
• Kombinací více akvizičních režimů lze dosáhnout maximální šíře i hloubky proteoformálního pokrytí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Velmi pravděpodobné směry dalšího vývoje:

• Optimalizace šířky a pořadí DIA izolačních oken pro zlepšené rozlišení souběžných nábojových stavů.
• Integrace vysokorychlostní spektrometrie s ion mobility separací pro extra dimenzi separace proteoform.
• Automatizace a strojové učení pro lepší rozpoznání nízko intenzitních prekurzorů.
• Aplikace na biologické vzorky s vysokou komplexitou (buňky, tkáně) pro mapování proteoform v kontextu chorob.

Závěr

Každá kombinace MS1 detektoru (ion trap vs. Orbitrap) a MS2 akvizice (DDA vs. DIA) nabízí specifické výhody. Pro komplexní top-down studie se doporučuje použití vícenásobných akvizic ve snímané posloupnosti, čímž se maximalizuje počet identifikovaných proteoform a rozšíří dynamický rozsah analýzy. Platforma ProSightPD v Proteome Discoverer 2.0 se osvědčila jako robustní nástroj pro automatickou dekonvoluci, identifikaci a kvantifikaci proteoform.

Reference

• Ivanov AR, Colangelo CM, Dufresne CP, et al. Interlaboratory studies and initiatives developing standards for proteomics. Proteomics. 2013;13(6):904–909.