Optimization of LC/MS Intact /Top-Down Protein Analysis on an Orbitrap Fusion Mass Spectrometer

Význam tématu

Intact/top-down analýza proteoform přináší jedinečnou schopnost identifikovat a kvantifikovat různé varianty bílkovin včetně posttranslačních modifikací a disulfidických vazeb, což je nad rámec klasického bottom-up přístupu. Tato metoda je proto klíčová pro pochopení funkčních vlastností bílkovin v biologických a průmyslových aplikacích.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vytvořit obecně použitelnou RP-LC-MS/MS metodu pro intact/top-down analýzu na Orbitrap Fusion hmotnostním spektrometru. Metoda byla optimalizována na standardní směsi sedmi proteinů a následně aplikována na charakterizaci směsi ribozomálních proteinů z E. coli.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano v mikroflow režimu, monolitické kapilární sloupce ProSwift RP-4H a RP-5H (200 μm × 25 cm), průtok 10–12 μL/min.
• Hmotnostní spektrometrie: Orbitrap Fusion v intact protein módu s ion-routing multipole (IRM) tlakem 2–3 mTorr.
• Fragmentace MS/MS: datově řízené módy Top 3–5 DDA s HCD, CID, ETD, EThcD a ETciD.
• Analýza dat: Protein Deconvolution 4.0 (ReSpect pro 15k, Xtract pro 120k), ProSightPC 3.0 a Proteome Discoverer 2.0 s ProSightPD uzlem.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný LC gradient (pro směs sedmi proteinů 10–25 % ACN/6 min, 25–40 %/5 min, 40–70 %/3 min) umožnil kompletní oddělení všech standardních proteinů v časovém okně 15 minut. Metoda byla úspěšně přenesena i na analýzu ribozomálních proteinů z E. coli při gradientu 5–40 %/38 min, 40–70 %/5 min. V porovnání fragmentačních režimů vedlo EThcD k nejvyššímu počtu identifikací i charakterizaci proteoform díky kombinaci elektronové a kolizně indukované fragmentace. HCD vedl ke snížení kvality pokrytí sekvence, zatímco ETD a ETciD doplňovaly spektra, zejména u proteinů s disulfidickými vazbami.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlé a reprodukovatelné oddělení intact proteinů v mikroflow režimu s nízkou spotřebou vzorku (řádově pmol).
• Komplexní pokrytí proteoform včetně modifikací a truníkovaných forem.
• Možnost snadné integrace do workflow kvality a výzkumu v proteomice.

Budoucí trendy a možnosti využití

Použití mikroflow LC-MS/MS v kombinaci s hybridními fragmentačními technikami slibuje další zvyšování hloubky analýzy proteomu. Rozvoj monolitických sloupců s vyšší kapacitou, optimalizace gradientů a pokročilé algoritmy dekonvoluce dat mohou umožnit analýzu ještě komplexnějších vzorků a nižších koncentrací.

Závěr

Popsaná metoda představuje robustní platformu pro rychlou intact/top-down analýzu na Orbitrap Fusion, která dosahuje vysoké citlivosti i kvality identifikací. Kombinace mikroflow chromatografie, multimódové fragmentace a pokročilých softwarových nástrojů poskytuje komplexní charakterizaci proteoform.

Reference

• Cannon et al. Anal. Chemistry. 2014, 86(4): 2185-2192.
• Thermo Fisher Scientific Product Specifications #20842.
• Brunner et al. Anal. Chemistry. 2015, PMID25803405.