Low Attomole Limit of Quantification on an Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer

Význam tématu

Citlivá kvantifikace nízkoabundantních proteinů a peptidů v komplexních biologických matricích představuje jeden z klíčových úkolů moderní proteomiky. Nízký obsah transkripčních faktorů či posttranslačních modifikací oproti celé proteomové populaci vyžaduje nástroje s vynikajícími limity detekce a kvantifikace, širokým dynamickým rozsahem a spolehlivou reprodukovatelností.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ukázat, jak nové generace hmotnostního spektrometru Orbitrap Fusion Lumos Tribrid posouvají dolní mez limitu kvantifikace (LOQ) do attomolové úrovně. Provedená srovnání zahrnovala cílené metody (PRM, WiSIM) i datově nezávislá akvizice (cDIA), přičemž se hodnotila citlivost, linearita, dynamický rozsah a opakovatelnost.

Použitá metodika a instrumentace

Vrstvy metodiky tvořily:

• Standardní směs stabilně izotopově značených syntetických peptidů (PRTC), vzorky HeLa nebo nádorového buněčného digestu.
• Kapalinová chromatografie spodní fáze s gradientem 5–40 % organické fáze na nanoUHPLC systému Easy nLC 1000 a kolonu PepMap Easy-Spray.
• Hmotnostní spektrometrie na Orbitrap Fusion Lumos Tribrid: datově závislá akvizice (DDA), paralelní monitorování reakcí (PRM), široká izolační vybraná iontová analýza (WiSIM) a klasická DIA (cDIA).
• Parametry: MS1 rozlišení až 240 000 FWHM, MS2 v Orbitrapu do 60 000 FWHM nebo v iontové pasti, HCD fragmentace, segmentovaný kvadrupól pro vylepšený přenos a zdroj s vyšším iontovým tokem.
• Datová analýza: Proteome Discoverer s Percolatorem pro generování spektrálních knihoven, Skyline a Spectronaut pro kvantifikaci.

Použitá instrumentace

Hlavním přístrojem byl Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer doplněný Easy nLC 1000 nanoUHPLC systémem a PepMap Easy-Spray kolonu. Jako detektory byly využity jak Orbitrap pro vysoké rozlišení, tak lineární iontová past pro rychlou MS2 validaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Targeted PRM přístup dosáhl LOQ až 1 attomol (CV < 15 %) se zachováním lineární odezvy přes více řádů koncentrace. WiSIM DIA umožnilo kvantifikovat peptidy až od 100 attomol v 1 µg složité matice. cDIA strategie při náloži 500 ng HeLa digestu kvantifikovala téměř 6 000 proteinových skupin s mediánovým CV 6,9 %, čímž retrivovala 92 % proteinů z vytvořené DDA knihovny. Ve srovnání s předchozí generací Orbitrap Fusion Tribrid došlo k nárůstu až o 30 % v počtu identifikovaných proteinových skupin a unikátních peptidů při zatížení 100 až 500 ng.

Přínosy a praktické využití metody

Nová platforma umožňuje:

• Studium nízkoabundantních biomarkerů a posttranslačních modifikací v klinických a výzkumných aplikacích.
• Kvantitativní analýzu proteomických výtěžků s minimálním množstvím vzorku.
• Implementaci citlivých QA/QC protokolů v biofarmaceutických i environmentálních laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Využití kombinovaných cílených a DIA strategií nabídne možnost multitargetového sledování stovek až tisíců peptidů v jediném běhu. Další směřování očekává integraci ultrarychlých chromatografických gradientů, automatizovanou analýzu dat pomocí umělé inteligence a rozvoj multiplexních technik pro klinické nasazení.

Závěr

Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS ukázal výrazné zlepšení citlivosti kvantifikace v attomolové oblasti při dobré linearitě a reprodukovatelnosti. Cílené i datově nezávislé metody na této platformě poskytují široký dynamický rozsah a vysokou spolehlivost pro moderní proteomické aplikace.

Reference

• Peterson et al. 2011 Parallel Reaction Monitoring for High Resolution and High Mass Accuracy Quantitative Targeted Proteomics Molecular Cellular Proteomics 11 1475–1488
• Kiyonami et al. 2014 Large Scale Targeted Protein Quantification Using WiSIM DIA Workflow on an Orbitrap Tribrid Mass Spectrometer Application Note AN64085
• Senko et al. 2013 Novel Parallelized Quadrupole Linear Ion Trap Orbitrap Tribrid Mass Spectrometer Improving Proteome Coverage and Peptide Identification Rates Analytical Chemistry 85(24) 11710–11714