Extending the Usefulness of HPLC with Electrochemical Detection

Význam tématu

HPLC s elektrochemickou detekcí (HPLC-ECD) představuje vysoce citlivou analytickou metodu s detekčními limity v řádu pM – kritická pro měření stopových látek. Nicméně selektivita ECD je omezena na redoxně aktivní sloučeniny. Rozšíření použitelnosti HPLC-ECD umožňuje detekovat širší spektrum analytů při zachování vysoké citlivosti.

Cíle a přehled studie / článku

Studie prezentuje čtyři přístupy k rozšíření rozsahu detekovatelných látek pomocí HPLC-ECD:

1. Předkolonní derivatizace
2. Immobilizované enzymy
3. On-line fotolýza
4. Nové pracovní elektrody (bor-dotovaný diamant – BDD)

Použitá metodika a instrumentace

Popsané experimenty využívají různé chromatografické sloupce, enzymatické reaktory a detekční články:

• Chromatografie: Thermo Scientific Accucore PhenylHexyl 3×100 mm, Restek BetaSil C18 4.6×250 mm, Capcell Pak MGII C18 75×1.5 mm, Restek Pinnacle C18 2.1×100 mm
• Enzymatický reaktor (SPR / IMER) s acetylcholinesterázou a cholinoxidázou
• Post-column fotolytická cívka Phred™ (254 nm lampy, PTFE knitte koil)
• Detekce: Thermo Scientific Dionex Coulochem™ III / CoulArray, Pt elektroda, BDD pracovní elektroda

Hlavní výsledky a diskuse

• Předkolonní derivatizace (OPA/β-ME) umožnila separaci a detekci 11 aminokyselin jako stabilních isoindolových derivátů s LOD v femtomolárním rozsahu.
• Immobilizované enzymy konvertují elektrochemicky inertní acetylcholin na H2O2, které je detekovatelné na Pt elektrodě (+275 mV) s vysokou selektivitou v mikrodialyzačních perfuzátech.
• On-line fotolýza zvýšila ECD odezvu u 13 výbušnin (HMX, RDX, TNT ad.), zlepšení LOD o 5–100× ve srovnání s UV detekcí (LOD 20–500 pg na kolonu).
• BDD elektrodou rozšířen rozsah aplikace až do potenciálů +2500 mV, umožňující generaci hydroxylových radikálů (elektrotagging) a detekci PAH, thiolů, disulfidů a genotoxinů (LOD v nízkopg úrovni).

Přínosy a praktické využití metody

Díky kombinaci derivatizace, enzymatických reaktorů, fotolýzy a nové elektrody lze v praxi detekovat a kvantifikovat vysoce nepolární, fotolyticky nebo enzymaticky inertní látky na úrovni stop v biochemii, farmaceutickém výzkumu a environmentální analýze.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vyšší integrace on-line reakcí a mikrofluidních systémů pro zvýšení automatizace a throughputu
• Vývoj nových derivatizačních činidel a fotolytických lamp s vyšší selektivitou
• Optimalizace BDD elektrod pro širší potenciálové okno a vyšší odolnost vůči foulingu
• Kombinace ECD s hmotnostní spektrometrií pro multimodální detekci

Závěr

Předložené přístupy významně rozšiřují možnosti HPLC-ECD a umožňují detekci mnoha dosud nedetekovatelných látek při zachování vysoké citlivosti. Metody nacházejí uplatnění v chemické, farmaceutické i environmentální analýze.

Reference

1. Acworth IN, Waraska J. Electrochemical measurement of electrochemically unreactive compounds: An examination of the use of derivatives and photolysis HPLC and coulometric detection. In: Acworth IN, Naoi M, Parvez H, Parvez S, eds. Coulometric Electrode Array Detectors for HPLC. VSP; 1997:351–376.
2. Thermo Fisher Scientific. Application Note 2423: Analysis of Neuroactive Amino Acids Using UHPLC and Electrochemical Detection. 2010.
3. Girelli AM, Mattei E. Application of immobilized enzyme reactor in on-line high performance liquid chromatography: A review. J Chromatogr B. 2005;819:3–16.
4. Fedorowski J, LaCourse WR. A review of post-column photochemical reaction systems coupled to electrochemical detection in HPLC. Anal Chim Acta. 2010;657:1–8.
5. Granger M. Personal communication. University of Utah; 2011.
6. Plante M, Bailey B, Acworth IN. Determination of Genotoxic Besylates and Tosylates by HPLC-ECD Using A Boron-Doped Diamond Electrode. LCGC Applications Notebook. Feb 2010.