Fast UHPLC Methods for Analysis of Amino Acids

Význam tématu

Rychlá a citlivá analýza aminokyselin je klíčová pro studium neurochemických procesů, zejména při monitorování změn v uvolňování neurotransmiterů in vivo a při zkoumání vlivu farmakologických látek. Zkrácení doby analýzy zvyšuje časové rozlišení a umožňuje efektivnější průběžné sledování dynamiky aminokyselin v biologických vzorcích.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje vývoj dvou rychlých UHPLC metod pro měření aminokyselin v homogenátech mozku potkanů a v mikrodiálnízních perfuzátech:

• Izokratická UHPLC metoda s elektrochemickou detekcí (ECD) pro separaci 11 neuroaktivních aminokyselin během 10 minut.
• Gradientní UHPLC metoda s fluorescenční detekcí pro simultánní měření volných D-a L-enantiomerů kyseliny asparagové a serinu během 20 minut.

Výsledky jsou demonstrovány na mozkových vzorcích kontrolních a amfetaminem ošetřených potkanů z různých oblastí mozku.

Použitá metodika a instrumentace

Biologické vzorky: homogenáty mozkové kůry, striata, mozkového kmene a hippocampu potkanů po léčbě amfetaminem vs. kontrola.
Extrakce: homogenizace v 0,3 N HClO₄, neutralizace octovou kyselinou, ředění vodou.
Derivatizace:

• Metoda ECD: precolumn derivatizace o-ftalaldehydem (OPA) s β-merkaptoethanolem, automatizováno na UHPLC.
• Metoda fluorescenční: precolumn derivatizace OPA s N-acetyl-L-cysteinou pro enantiomerní rozlišení.

Instrumentace (Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 série):

• Pumpy DPG-3600RS (isokratická) a HPG-3400RS (gradientní)
• Autosamplery WPS-3000TRS
• Elektrochemický detektor ECD-3000RS s buněčkou 6011RS
• Fluorescenční detektor FLD-3400RS (Ex 340 nm, Em 450 nm)
• Kolonové termostaty TCC-3000RS
• Služné kolony Accucore C18 (2,6 µm, 100×3 mm) a Hypersil GOLD (1,9 µm, 200×2,1 mm)
• Chromatografický software Chromeleon 6.8 SR11

Hlavní výsledky a diskuse

Izokratická ECD metoda:

• Separace 11 aminokyselin (např. Glu, GABA, Asp, Gly, Ser) za 10 min. při průtoku 0,8 mL/min a teplotě 45 °C.
• Detekční limity 10–40 pg na kolonu, zachovaná rozlišitelnost a citlivost ve srovnání s tradičním HPLC.
• Amfetamin zvýšil hladiny Glu a GABA v mozkovém kmenu o >200 % a Asp o 26 %; v hippocampu však snížení o 61 % u Asp a o 25 % u Glu.

Gradientní fluorescenční metoda:

• Rozlišení D- a L-enantiomerů Asp a Ser za 20 min při průtoku 0,25 mL/min a teplotě 35 °C.
• Detekční limity 200–400 fg na kolonu; identifikovány dva interferenční vrcholy, z nichž jeden koreluje s L-Asp, druhý ko‐eluuje s enantiomerou.
• Při amfetaminové stimulaci vzrostly v mozkovém kmenu D-Asp o 442 % a D-Ser o 8499 %, v hippocampu o 875 % resp. 959 %.

Přínosy a praktické využití metody

Obě UHPLC metody přinášejí výrazné zkrácení analýzy a zvýšení citlivosti, což dovoluje:

• Vyšší propustnost vzorků v preklinickém i klinickém výzkumu.
• Monitorování rychlých změn neurotransmiterů v mikrodiálnízních perfuzátech.
• Enantiomerní kvantifikaci D-aminokyselin s potenciálem pro studium neuroendokrinních a patofyziologických procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj UHPLC technik s integrací mass spectrometrie pro zlepšení selektivity, vývoj nových derivatizačních činidel pro širší spektrum sloučenin a automatizované platformy pro vysokokapacitní screening. Možné aplikace zahrnují klinickou diagnostiku neurodegenerativních onemocnění, farmakokinetické studie a toxikologii.

Závěr

Vyvinuté UHPLC metody umožňují rychlou, citlivou a enantiomerně selektivní analýzu neuroaktivních aminokyselin a D/L-enantiomerů Asp a Ser v biologických matricích. Výsledky potvrzují schopnost odhalit významné regionální a farmakologické změny v mozku.

Reference

• DʼAniello, A. D-Aspartic acid: An endogenous amino acid with an important neuroendocrine role. Brain Res. Rev. 2007, 53, 216–234.
• Bruckner, H.; Haasmann, S.; et al. Liquid chromatographic determination of D- and L-amino acids by derivatization with o-phthaldialdehyde and chiral thiols. J. Chromatogr. A 1994, 611, 259–273.
• Bruckner, H.; Wittner, R. Automated enantioseparation of amino acids by derivatization with o-phthaldialdehyde and N-acetylated cysteines. J. Chromatogr. 1989, 476, 73–82.