Analysis of Neuroactive Amino Acids Using UHPLC and Electrochemical Detection

Význam tématu

Aminokyseliny jako neurotransmitery hrají klíčovou roli v excitaci a inhibici centrálního nervového systému. Analýza jejich profilu v mikroobjemových vzorcích (mikrodialyzátech) umožňuje pochopení neurochemických změn při neurologických onemocněních a farmakologických intervencích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo zavést a ověřit metodu ultrarychlé kapalinové chromatografie (UHPLC) kombinované s novou coulometrickou elektrochemickou detekcí (ECD) pomocí analytické cely model 6011 ultra. Studie hodnotila dobu analýzy, rozlišení, citlivost a stabilitu precolumn derivace o-ftalaldehydem (OPA) s β-merkaptoethanolem (β-ME).

Použitá metodika a instrumentace

• Derivace: automatizovaná precolumn reakce OPA/β-ME (isoindolové deriváty).
• Vzorky: mikrodiályzát z prefrontální kůry CD-1 potkanů, stabilizace 2 h, odběr po 20 min. během normální i vysokodraselné aCSF perfuze.
• UHPLC: kolona Shiseido Capcell Pak C18 IF, 2,1×50 mm, 2 µm; izokratická mobilní fáze 100 mM Na2HPO4, 22 % methanol, 3,5 % acetonitril, pH 6,75; teplota 48 °C, průtok 0,28 mL/min.
• Detekce: Coulochem III s Model 6011 ultra Analytical cell (E1 +150 mV, E2 +550 mV) a guard cell Model 5020 (+600 mV).
• Přístroje: pumpa ESA 584, autosampler 542, datová stanice ESA Elite.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kompletní rozlišení excitatorních (Asp, Glu) i inhibitorních (GABA, TAU, Gly) aminokyselin během 15 min cyklu.
• Lineární kalibrace s koeficienty korelace > 0,995 pro všechny sledované deriváty.
• Při vysokém K+ významný nárůst GABA a taurinu, bez změny glutamátu.
• Minimální meziběhové přenosy (carry-over) a vynikající reprodukovatelnost retencí.
• UHPLC oproti konvenční HPLC: 50 % kratší retenční čas GABA, užší špičky, vyšší citlivost a zachování stability nestabilních derivátů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda významně zkracuje dobu analýzy, snižuje spotřebu rozpouštědel a zvyšuje laboratorní kapacitu. Je vhodná pro neurofarmakologický výzkum, monitorování in vivo, kvalitativní i kvantitativní hodnocení neurotransmiterů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace hmotnostní detekce (UHPLC-MS), multiplexní derivace, plná automatizace, rozšíření na další neurochemické látky, aplikace v preklinických i klinických studiích in vivo.

Závěr

Spojení UHPLC s coulometrickou ECD v analytické cele model 6011 ultra nabízí rychlou, citlivou a reprodukovatelnou analýzu neuroaktivních aminokyselin v mikroobjemových vzorcích. Metoda zvyšuje throughput, snižuje dobu měření a zlepšuje detekční limity.

Reference

1. McGeer PL, McGeer EG. Amino Acid Neurotransmitters. In Basic Neurochemistry; 4th ed.; Raven Press, 1989; pp. 311–332.
2. Lasley SM, Greenland RD, Michaelson IA. Determination of γ-Aminobutyric and Glutamic Acids in Rat Brain by Liquid Chromatography with Electrochemical Detection. Life Sci. 1984;35:1921–1930.
3. Donzanti BA, Yamamoto BK. An Improved and Rapid HPLC-EC Method for the Isocratic Separation of Amino Acid Neurotransmitters from Brain Tissue and Microdialysis Perfusates. Life Sci. 1988;43:913–922.