Analysis of Immunosupressant Drugs in Whole Blood Using a High-Efficiency Method on an Affordable High-Resolution Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza imunosupresivních léčiv v krevním séru je klíčová pro optimální terapeutickou kontrolu pacientů po transplantaci a v klinických studiích. Přesné a rychlé stanovení koncentrace tacrolimu, sirolimu, everolimu a cyklosporinu A přispívá k minimalizaci rizika odmítnutí štěpu a nežádoucích účinků lékové terapie.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit výkonnost přístroje Q Exactive Focus (hybrid kvadro­pol–Orbitrap) jako kvantitativní platformy pro dvouminutovou HPLC–MS analýzu čtyř klíčových imunosupresiv v lidské krvi. Studie porovnává citlivost, přesnost a shodu výsledků s referenční metodou na trojitém kvadro­pólu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly připraveny proteinovou precipitací: 100 µl krve bylo ošetřeno 150 µl roztoku ZnSO4 a 250 µl methanolu s interními standardy (ascomycin, cyklosporin D). Po centrifugaci se supernatant vstřikoval do analytické kolony.
Liquid chromatography

• UltiMate 3000RS pumpa s OAS autosamplerem
• Gradientní eluce na 2 minuty s 10 mM HCOONH4 + 0,1 % kyseliny mravenčí (fáze A) a methanol (fáze B)

Mass spectrometry

• Q Exactive Focus s Ion Max zdrojem a HESI-II sondou
• Režim PRM: izolace prekurzorového iontu (2 m/z), fragmentace v HCD buňce, detekce ve vysokém rozlišení 17 500 FWHM (m/z 200)
• Vyhodnocení v TraceFinderu, extrakce chromatogramů s přesností 5 ppm

Hlavní výsledky a diskuse

Meze kvantifikace (LOQ) odpovídaly nejnižším kalibračním koncentracím (2,27–26,1 ng/ml). Linearity kalibračních křivek byla pro všechny analyty velmi dobrá (R² > 0,97). Intra- i inter-assay přesnost < 7 % RSD, přesnost stanovení v QCs v rozsahu ±17 %. Matricový efekt 82–112 % recovery. Metoda vykázala korelaci se standardní troj-kvadro­pólovou metodou pro tacrolimus a cyklosporin A (slope ~ 1, R² > 0,97).

Přínosy a praktické využití metody

Třída Q Exactive Focus nabízí kombinaci vysoké selektivity Orbitrapu s rychlostí stanovení tradičního kvadro­pólu. Zkrácená analýza na 2 minuty umožňuje až ~ 60 měření za hodinu, což zvyšuje laboratorní kapacitu a urychluje rozhodovací procesy v klinickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti dalšího vývoje zahrnují implementaci čtyřkanálových LC systémů pro paralelní analýzu, rozšíření panelu imunosupresiv o nové molekuly a adaptaci metody pro terapeutický monitoring v reálném čase s minimem předúpravy.

Závěr

Vyvinutá dvouminutová HPLC–MS metoda na Q Exactive Focus prokazuje vysokou citlivost, přesnost a robustnost. Splňuje požadavky klinického výzkumu a poskytuje efektivní alternativu ke klasickým trojním kvadro­pólovým postupům.

Reference

1. Gao M., Kozak M. Analysis of Immunosuppressant Drugs in Whole Blood Using a High-Efficiency Method on a Q Exactive Focus Mass Spectrometer. Thermo Fisher Scientific Application Note 632, 2015.