Measuring Choline and its Metabolites in Human Plasma Using an LC/MS/MS System with Fully Automated Sample Preparation Module

Význam tématu

Cholin a jeho metabolity trimethylamin (TMA) a trimethylamin N-oxid (TMAO) jsou klíčovými biochemickými markery v oblasti kardiovaskulární patologie. Hladiny TMAO korelují s rizikem arteriosklerózy a prognózou srdečního selhání, proto je přesná a spolehlivá analýza těchto sloučenin v biologických matricích zásadní pro klinický výzkum a diagnostiku.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované práce bylo vyvinout a validovat plně automatizovaný postup pro kvantifikaci cholinu, TMA a TMAO v lidské plazmě s využitím automatického modulu CLAM-2030 spojeného s kapalinovou chromatografií se tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC/MS/MS). Studie demonstruje zkrácení času přípravy vzorku, minimalizaci variability a zajištění vysoké produktivity analýzy.

Použitá instrumentace

• Automatický modul CLAM™-2030 pro deproteinizaci vzorků a přidání interních standardů.
• Kapalinový chromatograf Nexera™ X2 vybavený Shim-pack Velox HILIC kolonkou (50×2,1 mm, 2,7 μm).
• Triplekvadrupólový hmotnostní spektrometr LCMS-8060 s ESI v pozitivním módu.

Metodika

Vzorky lidské plazmy byly automaticky deproteinizovány a doplněny o izotopově značené interní standardy (cholin-d13, TMA-d9, TMAO-d9). Kalibrační řady přípravků obsahovaly cholin v rozmezí 1–1 000 nmol/L, TMA 10–1 000 nmol/L a TMAO 10–10 000 nmol/L. Chromatografická separace probíhala gradientem vodného roztoku amonného formiátu s 0,1 % formiové kyseliny (fází A) a acetonitrilem (fází B), při průtoku 0,4 mL/min a teplotě kolony 40 °C. Objem injekce činil 3 μL. MS detekce pracovala v režimu MRM, udržující velmi krátké analýzy (~5 min na vzorek včetně přípravy a měření).

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrační křivky pro všechny analyty prokázaly vysokou linearitu (R2 = 0,997–0,999). Reprodukovatelnost na nejnižší úrovni kalibrace dosahovala %RSD 2–14 % a přesnost byla 86–96 %. Měřené koncentrace v lidské plazmě (n = 3) se pohybovaly kolem 938 nmol/L pro cholin, 685 nmol/L pro TMA a 655 nmol/L pro TMAO s RSD pod 5 %. Systematická analýza ukázala vysokou robustnost a nízkou variabilitu procesu díky plné automatizaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné snížení manuálních kroků při přípravě vzorků a eliminace operátorských chyb.
• Vysoká propustnost analytického workflow (~12 vzorků/hod).
• Využití klinického výzkumu, farmakokinetiky a rutinního QA/QC v biochemických a diagnostických laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může směřovat k rozšíření multiplexní analýzy o další metabolity, integraci automatizace s cloudovými platformami pro vzdálenou správu dat a využití umělé inteligence pro pokročilou interpretaci výsledků. Miniaturizace modulů a propojení s bodovou diagnostikou (POC) otevírá možnosti rychlého vyšetření na lůžku pacienta.

Závěr

Prezentovaný systém CLAM-2030 + LCMS-8060 umožňuje efektivní, rychlou a spolehlivou kvantifikaci cholinu a jeho metabolitů v lidské plazmě. Vysoká linearita, reprodukovatelnost a automatizace celého procesu zajišťují široké využití v klinických i výzkumných aplikacích.

Reference

• Wang Z, Hazen SL et al. Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease. Nature. 2011;472:57–63.
• Yazaki Y, Aizawa K et al. Ethnic difference in association of outcomes with trimethylamine N-oxide in acute heart failure patients. ESC Heart Fail. 2020;7(5):2373–2378.