Simultaneous Extraction of Aldosterone and Angiotensin I and II from Human Plasma Using EVOLUTE® EXPRESS ABN Prior to LC/MS Analysis

Význam tématu

Simultánní extrakce aldosteronu a angiotensinů I a II z lidské plazmy je klíčová pro spolehlivé stanovení aktivity reninu a diagnostiku primárního aldosteronismu, významné příčiny sekundární hypertenze. Optimalizace přípravy vzorku zvyšuje citlivost, zkracuje čas analýzy a snižuje náklady v klinických i výzkumných laboratořích.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyvinout a ověřit metodiku pro simultánní izolaci aldosteronu společně s angiotensiny I a II z plazmy pomocí EVOLUTE EXPRESS ABN SPE desek před následnou analýzou LC-MS/MS. Studie si klade za úkol zajistit vysoké výtěžky, nízké mezní hodnoty a reprodukovatelnost v běžných laboratorních podmínkách.

Použitá metodika

Vzorek plazmy (250 µL) byl okyselený, obohacen interním standardem (aldosteron-D4) a inkubován s pufrem pro potlačení konverze angiotensinu I na II. Po ukončení reakce formiovou kyselinou následovalo SPE na EVOLUTE EXPRESS ABN destičkách: kondice metanolem, equilibrace amoniakální vodou, nanesení vzorku, promytí nepolárních interferencí a selektivní eluční kroky pro angiotensiny (2 % NH4OH v 50/50 MeOH/H2O) a aldosteron (ethylacetát). Suchá extrakty byly rekonstituovány v 30 % metanolu s 0,4 % kyselinou formiovou. Chromatografické oddělení proběhlo na biphenylovém sloupci při gradientu ammoniumfluoridu a methanolu. Detekce ve Shimadzu 8060 QqQ MS v ESI modu s optimalizovanými MRM přechody.

Použitá instrumentace

• EVOLUTE EXPRESS ABN 30 mg SPE desky (Biotage)
• Biotage PRESSURE+ 96 pozitivní tlakový manifold
• Biotage SPE Dry koncentrátor vzorků
• Shimadzu Nexera UHPLC s Restek Biphenyl 50×2,1 mm, 1,7 µm
• Shimadzu 8060 Triple Quadrupole MS s ESI rozhraním

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje extrakčních výtěžků > 80 % při RSD < 5 % pro všechny analyty. Eliminace fosfolipidů byla prokázána porovnáním profilů MRM signálů 184 m/z po etylacetátové eluci oproti srážce acetonitrilem. Chromatogramy ukazují čisté a dobře oddělené píky při koncentracích od 1 ng/mL. Kalibrační křivky ve 10–10000 pg/mL vykazují linearitu r2 > 0,999; LLOQ je 10 pg/mL pro angiotensiny a < 25 pg/mL pro aldosteron.

Přínosy a praktické využití metody

• Simultánní izolace tří hormonů z jednoho vzorku zvyšuje průtok vzorků
• Snížení spotřeby reagen­cií a pracovní doby v porovnání s oddělenými procedurami
• Vysoká citlivost a přesnost umožňují detekci nízkých koncentrací relevantních pro klinickou diagnostiku

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace přípravy vzorku pro vysokoprocesní laboratoře
• Rozšíření metodiky na další peptidové hormony a metabolity
• Integrace s platformami pro vysokokapacitní screening
• Miniaturizace a využití v terénních a point-of-care diagnostických systémech

Závěr

Navržená metoda umožňuje efektivní a reprodukovatelné simultánní stanovení aldosteronu a angiotensinů I a II z lidské plazmy s vysokou citlivostí, selektivitou a průchodností. Výsledky podporují její implementaci do klinických laboratoří pro diagnostiku poruch renin-angiotensin-aldosteronového systému.

Reference

• Biotage. Application Note AN894, 2018. Simultaneous Extraction of Aldosterone and Angiotensin I and II from Human Plasma Using EVOLUTE EXPRESS ABN Prior to LC/MS Analysis.