Extraction of a Comprehensive Steroid Panel from Human Urine Using EVOLUTE® EXPRESS ABN Prior to LC/MS-MS Analysis

Význam tématu

Analýza steroidních hormonů v moči je klíčová pro klinickou diagnostiku, farmakokinetické studie i sledování hormonální rovnováhy u pacientů. Rychlá a spolehlivá příprava vzorku před LC-MS/MS umožňuje přesné stanovení širokého spektra steroidů na nízkých úrovních a zvyšuje produktivitu laboratorního provozu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout robustní metodu extrakce a kvantifikace 19 steroidů z lidské moči pomocí EVOLUTE EXPRESS ABN SPE 96-well destiček a následné HD-MS/MS analýzy. Metoda byla testována manuálně i automatizovaně pro posouzení efektivity, reproducibility a linearity v rozsahu 1–1000 pg/mL.

Použitá metodika a instrumentace

Pro předúpravu 200 µL moči se přidalo 20 µL deuterovaných interních standardů. Vzorky se 1:1 zředily vodou a aplikovaly na ABN 10 mg destičku. Postup SPE zahrnoval volitelné kondicionování metanolem, equilibraci 0,1% kyselinou mravenčí, dvě fáze praní vodou a vodou:methanolem (60:40) a eluční krok metanolem. Vzorky se vysušily proudem vzduchu/plynu při 40 °C a rekonstituovaly mobilní fází (50:50).

UHPLC separace proběhla na Shimadzu Nexera X2, kolona ACE C18 (100×2,1 mm, 1,7 µm) při 40 °C, mobilní fáze A: 0,2 mM NH4F, B: metanol, gradient od 50:50 do 5:95 v 9,2 min. MS detekce na Shimadzu 8060 QqQ s ESI v pozitivním i negativním módu.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný protokol dosahuje průměrných výtěžností > 75 % a RSD < 5 % pro většinu analyzovaných steroidů. Linearita kalibračních křivek má r² > 0,999 v rozsahu 1–1000 pg/mL, LLOQ od 1 do 250 pg/mL v závislosti na sloučenině. Chromatogramy moči obohacené na 5 ng/mL ukazují dobrou separaci izobarů a dostatečnou citlivost v obou iontových módech. Porovnání manuální a automatizované přípravy prokázalo srovnatelné výsledky.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost vzorků díky 96-well formátu a možnosti automatizace na Biotage Extrahera.
• Jednoduchá příprava s minimem kroků a nízkou spotřebou organických rozpouštědel.
• Vysoká citlivost a přesnost kvantifikace steroidů na úrovních pg/mL vhodná pro klinické a výzkumné aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další zvýšení citlivosti použitím alternativních elučních rozpouštědel nebo optimalizací gradientu.
• Rozšíření panelu o další steroidy či metabolity a adaptace na jiné biologické matrix.
• Integrace do plně automatizovaných linek pro vysokokapacitní screening a klinickou diagnostiku.

Závěr

Popsaná metoda nabízí rychlou, reprodukovatelnou a vysoce výkonnou přípravu lidské moči pro komplexní panel steroidů. Kombinace EVOLUTE EXPRESS ABN SPE a UHPLC-MS/MS zajišťuje vysoké výtěžnosti, nízké RSD a vynikající linearitu, což podporuje její uplatnění v klinické praxi i vědeckém výzkumu.