Quantification of Warfarin and Furosemide in Human and Rat Plasma for Discovery Bioanalysis Using ACQUITY™ Premier UPLC™ System and Xevo™ TQ Absolute Mass Spectrometer

Význam tématu

Analytická kvantifikace léčiv ve vzorcích biologických tekutin je klíčová pro vývoj a hodnocení bezpečnosti a účinnosti nových terapeutik.
Warfarin a furosemid představují modelové sloučeniny s úzkým terapeutickým rozsahem a vyžadují citlivé metody pro stanovení nízkých koncentrací.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout univerzální, rychlou a vysoce citlivou metodu pro extrakci a kvantifikaci warfarinu a furosemidu z lidské a potkaní plazmy.
Metoda kombinuje proteinovou precipitaci acetonitrilem s separací pomocí ACQUITY™ Premier UPLC™ a detekcí na Xevo™ TQ Absolute v režimu ESI-.

Použitá metodika a instrumentace

Proteinová precipitace: poměr plazma:acetonitril 1:3, následné odcentrování a přenos supernatantu do vialky.
Chromatografie:

• Systém: ACQUITY™ Premier UPLC System
• Kolona: MaxPeak™ UPLC HSS T3, 2,1 × 50 mm, 1,8 μm, teplota 60 °C
• Objem injekce: 1 μL, teplota vzorku 5 °C
• Mobilní fáze A: 0,01 % kyselina mravenčí ve vodě; B: 0,01 % kyselina mravenčí v acetonitrilu
• Gradient: 5–95 % B během 1,5 minuty; průtok 600 μL/min

Hmotnostní spektrometrie:

• Přístroj: Xevo™ TQ Absolute Mass Spectrometer
• Režim ionizace: ESI-, kapilární napětí 0,5 kV
• MRM přechody optimalizované pro warfarin a furosemid

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární odezvu v rozsahu 0,025–100 ng/mL pro warfarin a 0,1–100 ng/mL pro furosemid ve všech maticích.
Limity kvantifikace (LLOQ) byly 25 pg/mL pro warfarin a 100 pg/mL pro furosemid, definované na základě poměru signál/šum ≥5.
Mezi-denní přesnost a preciznost (% CV) ve všech bodech kalibrační křivky i kontrolách kvality byly pod 12 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysokou citlivost, přesnost a reprodukovatelnost bez potřeby složitých kroků přípravy vzorku.
Univerzální přístup je vhodný pro obvyklé požadavky objevné bioanalýzy až po farmakokinetické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření aplikace na další farmaceutické kandidáty s obtížnými fyzikálně-chemickými vlastnostmi.
Možnost integrace automatizovaných extrakčních postupů pro zvýšení propustnosti laboratoře.
Využití povrchových úprav HPS pro minimalizaci absorpce iontů kovů a zvýšení robustnosti metody.

Závěr

Popsaná metoda kombinuje ACQUITY™ Premier UPLC a Xevo™ TQ Absolute pro citlivé, přesné a reprodukovatelné stanovení warfarinu a furosemidu v lidské a potkaní plazmě.
Výsledky potvrzují vhodnost této platformy pro rychlou a spolehlivou bioanalytiku v průmyslových a výzkumných laboratořích.

Reference

• Bateman KP, Cohen L, Emary B, Pucci V. Standardized Workflows for Increasing Efficiency and Productivity in Discovery Stage Bioanalysis. Bioanalysis. 2013;5(14):1783–1794.
• Meng M, Wang L, Voelker T, Reuschel S, Van Horne K, Bennett P. A Systematic Approach for Developing a Robust LC-MS/MS Method for Bioanalysis. Bioanalysis. 2013;5(1):91–115.