An Optimized Sample Preparation Method of Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues for Mass Spec Applications

Význam tématu

Formalinem fixované parafinem embedované (FFPE) tkáňové bloky představují rozsáhlý archiv biologicky významných vzorků v nemocnicích a biobankách. Proteomická analýza těchto archivních vzorků pomocí hmotnostní spektrometrie odhaluje informace o expresi a post-translačních modifikacích proteinů, které jsou klíčové pro pochopení onemocnění, identifikaci biomarkerů a personalizovanou medicínu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat protokol pro extrakci proteinů z FFPE tkání kompatibilní s hmotnostně spektrometrickou (MS) přípravou vzorků a následnou LC-MS/MS analýzou. Protokol byl ověřen na vzorcích prsní, plicní a tlustostřevní tkáně, porovnán se zmraženými (FF) vzorky a testován pro robustnost napříč normálními i tumorovými vzorky.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda byla rozdělena do klíčových kroků:

• Odstranění parafinu a rehydratace sekcí (1–2 hodiny)
• Lýza a dekrosslinking v EasyPep lysis bufferu s mechanickým rozrušením micro pestlem a sonikací, následné zahřívání při 95 °C (2 hodiny) a centrifugace (0,5 hodiny)
• Digesce a příprava peptidů pomocí EasyPep Mini MS Sample Prep Kit
• Kvantifikace proteinů barvivem BCA a peptidů kolorimetrickým peptide assay
• TMT10plex izobarické značení, quenche, kombinace vzorků
• Frakcionace pomocí Pierce High pH Reversed-Phase spin kolonek
• LC-MS/MS na systému Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 Nano LC se 50 cm C18 EASY-Spray kolonkou (acetonitrilový gradient 5–50 %), detekce na Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap
• Analýza dat v Proteome Discoverer 2.2 se Sequest HT, vyhledávání proti databázi Uniprot, FDR 1 %

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný protokol s EasyPep lysis pufrem a mechanickou homogenizací vedl k nejvyšším výtěžkům proteinů ve všech testovaných tkáních. Z každého vzorku bylo identifikováno 2 000–3 500 proteinů. Aplikace TMT10plex reagencií umožnila relativní kvantifikaci až 5 000 proteinů napříč vzorky. Porovnání FFPE a čerstvě zmražených vzorků vykázalo srovnatelný počet identifikovaných proteinů, PCA analýza jasně oddělila jednotlivé typy tkání a biologické replikáty. Analýzy odhalily i specifické rozdíly v abundanci proteinů mezi tumorovými a normálními vzorky.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný workflow umožňuje využít rozsáhlá FFPE archiva pro proteomické studie, poskytuje vysokou reprodukovatelnost a kompatibilitu s komerčními sadami a LC-MS/MS platformami. Metoda je vhodná pro průmyslovou QA/QC, traslační výzkum a objevování biomarkerů ze vzácných či starších vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj v oblasti hromadných izobarických značících činidel s vyšším plexem, aplikace datově nezávislé akvizice (DIA), profiling post-translačních modifikací, single-cell proteomika z FFPE sekcí a automatizovaná příprava vzorků v kombinaci s AI-řízenou analýzou dat otevírají nové možnosti pro hluboké proteomické charakterizace archivních tkání.

Závěr

Studie představuje robustní, reprodukovatelný a široce aplikovatelný protokol pro extrakci a analýzu proteinů z FFPE tkání. Metoda zajišťuje vysoké výtěžky, identifikaci tisíců proteinů a je kompatibilní s rutiními LC-MS/MS platformami a izobarickými značeními.

Reference

• Kara Zehr, Bhavin Patel, Amarjeet Flora, Penny Jensen, Sergei Snovida, Ryan Bomgarden, Kay Opperman, John C Rogers. An Optimized Sample Preparation Method of Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues for Mass Spec Applications. Thermo Fisher Scientific, 2020.