Increasing the depth of single shot proteomics with enhanced data acquisition and processing strategies

Význam tématu

Single-shot proteomika představuje rychlý způsob detailní analýzy komplexních proteomových vzorků bez potřeby frakcionace. Zvýšení hloubky pokrytí proteomu v jediném běhu zkracuje dobu analýzy i spotřebu materiálu, což je klíčové v klinických studiích, průmyslové kontrole kvality i farmaceutickém výzkumu.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo prozkoumat a optimalizovat kombinaci akvizičních parametrů hmotnostního spektrometru a pokročilých algoritmů pro zpracování dat s cílem maximalizovat počet identifikovaných peptidů a proteinových skupin v single-shot experimentech. Studie porovnává:

• Detekci fragmentů v Orbitrap (OT/OT) vs. iontové pasti (OT/IT).
• Různé šířky izolačního okna (0,4–3 Th).
• Různé hodnoty maximální doby injekce (MaxIT).
• Užití FAIMS Pro Duo rozhraní s jedním až třemi kompenzačními napětími (CV).
• Výpočetní workflow v Proteome Discoverer 3.0: Sequest HT s INFERYS Rescoring vs. nový CHIMERYS inteligentní vyhledávací algoritmus.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: komerční HeLa digesť.
Separace: UHPLC Vanquish Neo na µPac Neo kolóně, průtok 300 nL/min, gradienty 30–180 min.
MS akvizice: Thermo Scientific™ Orbitrap Eclipse Tribrid, OT/IT a OT/OT módy, šířky izolačního okna 0,4–3 Th, MaxIT 10–35 ms, FAIMS Pro Duo (-40, -50, -60, -70, -80 CV).
Zpracování dat: Proteome Discoverer 3.0 s workflow Sequest HT + INFERYS a CHIMERYS + Percolator.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimální izolační okna: 2–4 Th pro OT/OT a 1,2–1,5 Th pro OT/IT s CHIMERYS přináší nejvyšší počet unikátních peptidů a proteinových skupin.
• MaxIT: 22 ms pro OT/OT a 15 ms pro OT/IT poskytují lepší kompromis mezi kvalitou spekter a počtem scanu.
• FAIMS Pro Duo: použití tří CV hodnot zvyšuje počet unikátních peptidů o ~31 % (110 078 vs. 83 929) oproti bez-FAIMS běhům.
• CHIMERYS vs. Sequest HT + INFERYS: nový algoritmus navýšil identifikace peptidů a proteinů o 25–36 % napříč různými zatíženími a délkami gradientu.
• Delší gradienty (2–3 h) ve spojení s CHIMERYS dále prohloubily pokrytí proteomu bez podstatného nárůstu času na analýzu na vzorek.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizované nastavení akvizice a výpočetní zpracování umožňuje:

• Rychlejší a hlouběji provedené laboratorní analýzy proteomů.
• Zvýšení průchodnosti vzorků při udržení vysoké kvality identifikací.
• Aplikaci ve farmaceutickém vývoji, klinické proteomice a QA/QC procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj hybridních algoritmů pro analýzu chimerických spekter a širší využití FAIMS či dalších IMS technologií může dále zvyšovat hloubku proteomového pokrytí. Další směřování zahrnuje integraci strojového učení pro predikci fragmentačních vzorců a automatizaci optimalizace parametrů akvizice.

Závěr

Kombinace širokého okna akvizice, vysoce výkonného front-endu FAIMS Pro Duo a pokročilých zpracovatelských algoritmů CHIMERYS ve frameworku Proteome Discoverer 3.0 významně zvyšuje počet identifikovaných peptidů a proteinových skupin v single-shot proteomice. Tento přístup zkracuje čas analýzy a zlepšuje hloubku proteomového pokrytí, což otevírá nové možnosti pro náročné aplikace v průmyslu i výzkumu.