Developments in Real-Time Search on an Orbitrap Tribrid Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza peptidů a proteinů v reálném čase přináší možnost optimalizovat rozhodování během chromatografického běhu. Implementace pokročilého filtrování na základě odhadu falešné míry objevů (FDR) a řízení počtu identifikovaných fragmentů zvyšuje citlivost a účinnost hmotnostní spektrometrie v proteomice.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo rozšířit schopnosti Real-Time Search na Orbitrap Eclipse Tribrid tak, aby zahrnovaly:

• filtraci výsledků na základě více parametrů prostřednictvím reálného odhadu FDR,
• funkci close-out k omezení počtu PSM pro jednotlivé proteiny,
• podporu analýzy neutrálního úbytku fragmentů a prekurzorů.

Studie byla testována na vzorcích kvasinek značených TMT v režimu LC-MS3.

Použitá metodika a instrumentace

Pro LC-MS byla použita nano chromatografie Easy-nLC 1200 s gradientem 2 hodiny a Orbitrap Eclipse Tribrid. Reálné vyhledávání MS/MS spekter provádí modifikovaná verze enginu Comet na hostitelském PC. Pro výpočet LDA byl využit Accord.NET Framework. Offline analýzy proběhly v Proteome Discoverer 2.4. Klíčové prvky metodiky:

• balancování cílových a decoy PSM k periodickému přepočtu LDA,
• aktualizace prahu skóre pro 20 % FDR každých 1000 PSM,
• close-out filtr pro maximalizaci unikátních proteinových identifikací.

Hlavní výsledky a diskuse

Reálné filtrování pomocí LDA a FDR vedlo k 10 procentnímu nárůstu MS3 triggerů při použití close-out. Implementace neutrálního úbytku rozšiřuje identifikační kapacitu pro posttranslační modifikace. Metoda umožňuje dynamické nastavení statistických prahů a výrazně zjednodušuje rozhodování o dalším fragmentačním kroku.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda zvyšuje efektivitu využití hmotnostního spektrometru a zkracuje dobu analýzy díky online filtrování. Omezení počtu PSM na protein zamezuje opakovaným měřením běžných proteinů v multi-frakcionovaných vzorcích. Podpora neutrálního úbytku usnadňuje detekci modifikovaných peptidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření close-out funkce na multi-run scénáře a další zlepšení algoritmů strojového učení. Integrace lokalizace PTM v reálném čase a adaptivní řízení fragmentace mohou dále zvýšit hloubku proteomických analýz.

Závěr

Rozšíření Real-Time Search o FDR filtrovanie, close-out a neutrální úbytek významně zlepšuje citlivost a produktivitu Orbitrap Tribrid systémů. Díky rychlým časům vyhledávání a paralelizaci práce metody lze nasadit v náročných proteomických aplikacích.

Reference

• Schweppe JD et al J Proteome Res 2020 19 2026-2034
• Eng JK et al JASMS 2015 26 1865
• Accord.NET Framework verze 3.8.0 dostupné online