Assessing Oxidation in IgG1 Monoclonal Antibodies and Correlating at both Intact Protein and Peptide Levels

Význam tématu

Oxidace methioninových zbytků v IgG1 monoklonálních protilátkách představuje významnou posttranslační modifikaci, která může ovlivnit bezpečnost a účinnost bioterapeutik. Systematické sledování oxidačních změn je proto klíčové při vývoji a kontrole kvality léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie je ověřit schopnost hmotnostního spektrometru Thermo Scientific™ Orbitrap Exploris™ 240 s BioPharma volbou detekovat a kvantifikovat oxidaci v mAbs na úrovni celého proteinu, subjednotek a peptidů. Jako modelové látky byly použity ipilimumab a golimumab vystavené oxidativnímu stresu pomocí H2O2.

Použitá metodika a instrumentace

Pro analýzu byly využity tyto kroky a přístroje:

• Intaktní hmotnostní analýza za denaturujících podmínek pomocí RP LC-MS (Vanquish Duo UHPLC + Orbitrap Exploris 240).
• Subjednotková analýza po štěpení IdeS proteázou, redukce a následná RP LC-MS.
• Peptidové mapování po tryptickém trávení (SMART Digest Trypsin) a analýza LC-MS/MS s HCD fragmentací.
• Software BioPharma Finder 4.0 pro dekonvoluci a vyhodnocení dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktní analýza prokázala u vzorků se 500 ppm H2O2 posun hmotnosti o přibližně 64 Da, indikující čtyři oxidované methioniny. Subjednotková analýza odhalila lokalizaci oxidace v podjednotkách Fd' i Fc pro oba mAbs. Peptidové mapování zvýraznilo peptid DTLMISR s přesným posunem +15.9949 Da, potvrzeným diagnostickými fragmenty y4 a y5 a ztrátou CH3SOH.
Kvantifikace ukázala síťovou závislost oxidačního stupně na koncentraci H2O2, přičemž nejvíce náchylné pozice (např. Met34, Met83, Met253, Met429 u ipilimumabu) dosahovaly až několika desítek procent oxidace.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Rychlou a přesnou detekci oxidačních modifikací v mAbs na třech úrovních struktury.
• Jednoduché přenesení metodiky mezi instrumenty díky přednastaveným šablonám.
• Komplexní charakterizaci Critical Quality Attributes pro vývoj a kontrolu bioterapeutik.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují:

• Další integraci multi-atributových metod pro automatizované monitorování PTM v reálném čase.
• Využití pokročilých algoritmů strojového učení pro rychlejší interpretaci vysokorozlišovacích dat.
• Rozšíření aplikací na další třídy biologických léčiv, včetně bispecifických protilátek a konjugátů.

Závěr

Orbitrap Exploris 240 s BioPharma volbou prokázal vynikající hmotnostní přesnost, jednoduchost obsluhy a schopnost poskytovat ortogonální data o oxidačních posttranslačních modifikacích v mAbs. Metoda nabízí robustní nástroj pro vývoj a kontrolu kvality moderních bioterapeutik.

Reference

• Kuo T et al, mAbs 2011, 3, 422–430
• Guan Z et al, J Am Soc Mass Spectrom 2003, 14, 605–613
• Pan H et al, Protein Sci. 2009, 18, 424–433