Rapid quantitation of therapeutic antibodies in animal plasma

Význam tématu

Rychlé a přesné stanovení terapeutických monoklonálních protilátek v séru a plasmatických vzorcích zvířat je klíčové pro preklinický vývoj, farmakokinetické studie a kontrolu kvality biotechnologických produktů. Vysoce citlivé metody založené na imunoadsorpci a hmotnostní spektrometrii obvykle vyžadují rozsáhlou a časově náročnou přípravu vzorku, která zabere až 24 hodin. Zkrácení této doby významně zvyšuje laboratorní propustnost a snižuje variabilitu analýzy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo ověřit možnosti rychlé kvantifikace nízkých hladin lidské IgG v myší plasmě za pomoci Thermo Scientific SMART Digest Immunoaffinity (IA) kitů (Streptavidin, Protein A, Protein G), které kombinují činění, očištění a trávicí krok v jedné 96-well destičce. Studie porovnala výkon tří typů kitů, optimalizovala podmínky obohacení a digesce a ověřila linearitu, citlivost a reprodukovatelnost metody.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda spočívá v imobilizaci teplotně stabilní trypsinové digesce a imunoadsorpčních reagencí na magnetické nebo netmagnetické částice. Všechny kroky obohacení a digesce probíhají ve stejném cyklu: nejprve při pokojové teplotě proběhne vazba cílové lidské IgG na biotinylovaný protilátkový reagen (Streptavidin kit) nebo na přímo vázanou anti-IgG protilátku (Protein A/G kity). Následně se zvyšuje teplota na 70 °C pro simultánní denaturaci a trávicí reakci po dobu 60 minut. Výstupní peptidy jsou po ukončení digesce okyseleny a přímo analyzovány LC-MS/MS.

Instrumentace:

• UHPLC Thermo Scientific UltiMate 3000 Rapid Separation Dual System
• Kolona Accucore C18, 2.1 × 50 mm, 2.6 μm
• Mass spektrometr Thermo Scientific Velos Pro ion trap, SRM režim
• Mobilní fáze: A – 0.1 % kyselina mravenčí ve vodě (98 %) + ACN (2 %); B – 0.1 % kyselina mravenčí ve vodě (10 %) + ACN (90 %); gradient 90→10→10→90 % A/B
• Parametry MS: pozitivní ionizace, HESI, detekce fragmentů m/z 603.4→805.4 a 937.7→836.5

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace ukázala, že obohacení i digesce dosáhnou maximální účinnosti po 60 minutách. Kalibrační křivky lidské IgG v myší plasmě pro všechny tři kity vykázaly lineární závislost v rozsahu 5–1 600 ng/mL (Streptavidin) a 6–6 000 ng/mL (Protein A/G) s R² > 0,995. Ve středních a vyšších koncentracích (50–500 ng/mL) byla zachována přesnost a opakovatelnost (CV < 3 %). Metoda umožnila detekci již od 5–6 ng/mL, což je více než desetkrát citlivější než klasické přístupy bez imunoadsorpce.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Snížení času přípravy vzorku z ~24 hodin na 3–4 hodiny
• Jednostupňový workflow s minimem pipetážních kroků
• Vyšší čistotu extraktu a citlivost LC-MS/MS díky imunoadsorpci
• Univerzální aplikaci pro řadu monoklonálních protilátek pomocí Fc-regionu
• Možnost přizpůsobení na magnetickém nebo netmagnetickém formátu a automatizaci

Budoucí trendy a možnosti využití

Přístup lze dále rozšířit o:

• Automatizované platformy (KingFisher) pro vysokou propustnost
• Další typy afinitních reagens (malé molekuly, nanobody)
• Integraci s multiplexními aplikacemi pro simultánní kvantifikaci více protilátek
• Využití v klinickém výzkumu a monitorování terapeutické odpovědi pacientů

Závěr

SMART Digest IA kity významně zjednodušují a zrychlují kvantitativní analýzu monoklonálních protilátek v biologických matricích. Spojením imunoadsorpce a teplotně aktivované digesce ve stejném kroku je dosaženo vysoké citlivosti (LOD < 10 ng/mL), robustnosti a širokého lineárního rozsahu, což je klíčové pro efektní preklinické a klinické studie.

Reference

1. Ewles M. et al. LC–MS/MS strategies for therapeutic antibodies. Bioanalysis 2016, 8(24):2565–2579.
2. Bardsley J. et al. Improvement in Speed and Reproducibility of Protein Digestion. Thermo Fisher Application Note AN21198, 2016.
3. Thermo Scientific. SMART Digest IA User Manual. Man-21549, 2017.
4. Thermo Fisher Scientific. Comparison of Antibody IgG Binding Proteins. Application Note, 2017.
5. Berna M., Ackermann B. Increased Throughput for Low-Abundance Protein Biomarker Verification by LC–MS/MS. Anal. Chem. 2009, 81:3950–3956.