SMART Digest ImmunoAffinity (IA) Kit User Manual

Význam tématu

Biomarkerové proteiny v komplexních biologických matricích se často vyskytují v nízkých koncentracích, což klade nároky na citlivou, selektivní a reprodukovatelnou přípravu vzorků. Imunoafinitní zachycení spojené s rychlou a efektivní proteolytickou digescí významně zvyšuje detekční schopnosti a zkracuje dobu analytického workflow.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem předloženého uživatelského manuálu je představit SMART Digest ImmunoAffinity IA Kit navržený pro kvantitativní stanovení proteinových biomarkerů. Kit kombinuje imunoafinitní sorbent (streptavidin, protein A nebo G) se stabilizovaným trypsinem na jediné sorpční perličce, čímž umožňuje:

• rychlou a jednoduchou imunoafinitní extrakci
• efektivní a zrychlenou proteolytickou digesci
• vysokou reprodukovatelnost a citlivost
• kompatibilitu s automatizovanými platformami

Použitá metodika a instrumentace

Workflow zahrnuje přípravu bioaktivních sond (biotinylace pro streptavidinovou variantu nebo glutaraldehydové zesítění pro protein A/G), navázání sond na perličky, praní, imunoafinitní zachycení cílového proteinu, aktivaci trypsinu zahřátím na 70 °C a digesci po dobu typicky 60 minut. Následuje odštěpení a čištění peptidů pomocí SOLAµ SPE destičky.

• Biotinylace a koncentrace sond dle doporučeného protokolu
• Vázání a křížové zesítění anti-tělových protilátek
• Imunoafinitní rekonstrukce na magnetických i nemagnetických perličkách
• Digesce při zvýšené teplotě pro urychlení proteolýzy
• Čištění peptidů SPE metodou
• Instrumentace: heater/shaker s vyhřívaným blokem a víkem, vakuový manifold se SOLAµ SPE deskou, vakuové čerpadlo, magnetické bloky, platformy KingFisher Duo Prime a Flex, UHPLC systémy pro následnou analýzu

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace SMART Digest IA Kit zkracuje celkový čas přípravy z tradičních 15–24 hodin na 3–4 hodiny. Kompletní digesce IgG je dosažena za 60–75 minut, u menších proteinů (insulin, BSA, lysozym) pak do 5 minut. Vazební kapacita 30 µL perliček činí ~5 µg protilátky, což zajišťuje konzistentní a reprodukovatelné výsledky.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda přináší výrazné zvýšení citlivosti analýzy díky odstranění rušivých složek vzorku a obohacení cílových proteinů. Jednoduchý postup umožňuje snadnou integraci do automatizovaných vyhodnocovacích platforem a je vhodný pro široké spektrum proteinových biomarkerů v klinických, farmaceutických a výzkumných aplikacích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj směřuje k dalšímu nárůstu propustnosti a miniaturizaci, lepší integraci on-line s UHPLC–MS systémy, multiplexním analýzám více biomarkerů paralelně a rozšíření imunoafinitních sorbentů. Digitální imunotesty a pokročilé bioinformatické platformy usnadní interpretaci dat a rozšíří možnosti personalizované medicíny.

Závěr

SMART Digest ImmunoAffinity IA Kit poskytuje rychlou, jednoduchou a vysoce reprodukovatelnou metodu pro selektivní zachycení a digesci proteinových biomarkerů. Zkrácení přípravného workflow a vysoká citlivost nabízejí efektivní řešení pro moderní bioanalytické laboratoře.

Reference

• Thermo Fisher Scientific: SMART Digest ImmunoAffinity IA Kit User Manual, Version 1, Revision A, August 2016