Analysis of 2-aminobenzamide Labeled Dextran Ladder on a Solid Core HPLC Column

Význam tématu

Separace a charakterizace glykanů patří mezi klíčové úlohy v oblasti glykomiky, proteomiky a biologického výzkumu. Glykanové struktury, včetně oligosacharidů a polysacharidů, slouží jako biomolekulární „otisky prstů“ na povrchu bílkovin a buněk a jsou často spojeny s detekcí onemocnění, jako je rakovina. Díky své vysoké polarity však glykanové fragmenty představují výzvu pro tradiční chromatografické techniky. Hydrofobní fází reverzní chromatografie není dostatečně retenční a iontová výměna nefunguje bez ionizovatelných skupin. HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography) se jeví jako ideální metoda pro efektivní retenci a rozlišení těchto vysoce polárních biomolekul.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo demonstrovat jednoduchou, opakovatelnou a vysoce účinnou separaci dextranové žebříku značené fluorescenčním barvivem 2-aminobenzamid (2-AB) na kolóně Accucore 150-Amide-HILIC se solidním jádrem. Studie se zaměřila na dosažení vysoké rozlišovací schopnosti, nízkého provozního tlaku a robustnosti metody vhodné pro konvenční vysokotlaké HPLC systémy.

Použitá instrumentace

• HPLC systém Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 RSLC s fluorescenčním detektorem FLD (excitační vlnová délka 330 nm, emisní vlnová délka 420 nm)
• Kolona Accucore 150-Amide-HILIC, 2.6 µm, 100 × 2.1 mm
• Chromeleon Chromatography Data System v7.0

Použitá metodika

Připraven byl pufr 50 mM amonného formiátu upravený na pH 4.5 formiovou kyselinou. Mobilní fáze A byla čistý acetonitril, mobilní fáze B 50 mM amonný formiát pH 4.5. Gradientní eluce probíhala od 20 % B do 50 % B během 40 min, poté 5 min izokraticky a návrat na počáteční podmínky do 50 min.

• Průtok: 0.5 mL/min
• Teplota kolony: 60 °C
• Objem injekce: 2–5 µL (oplach 80:20 acetonitril:voda)
• Zpětný tlak: cca 110 bar na začátku, 160 bar v gradientním maximu

Hlavní výsledky a diskuse

Při injekci 2 µL bylo na chromatogramu rozlišeno nejméně 11 homopolymerů dextranové žebříku se středními rozlišovacími faktory Rs ≈ 9.97 (prvních 5 piků) a Rs ≈ 3.39 (píky 6–10, vypočteno dle Evropského farmakopejního vzorce). Trojité replikáty prokázaly vysokou opakovatelnost s relativními odchylkami %RSD pod 0.5 % pro retenční časy všech identifikovaných látek. Při zvýšení objemu injekce na 5 µL se počet detekovaných homopolymerů rozšířil až na 21, což potvrzuje schopnost kolony rozlišit i vyšší řády sacharidových oligomerů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí jednoduché a robustní rozlišení glykanových oligomerů s vynikajícími separačními parametry při tlacích kompatibilních s konvenčními HPLC systémy. Otevřená aplikace HILIC s amido-fází umožňuje snadné zařazení do rutinních laboratoří pro glykanovou analýzu, kontrolu kvality potravin, léků a biologických vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj lze očekávat v kombinaci HILIC s hmotnostní spektrometrií pro detailní strukturální charakterizaci glykanů. Rozšíření metodiky na komplexní biologické vzorky, multiplexní analýzy glykopeptidů a high-throughput screening představuje perspektivní směr pro farmaceutický výzkum, klinickou diagnostiku a biofarmaceutický průmysl.

Závěr

Accucore 150-Amide-HILIC kolona se solidním jádrem poskytuje vysoce účinnou, reprodukovatelnou a nízkotlakou separaci 2-AB značené dextranové žebříku. Metoda umožňuje detekci minimálně 21 glykanových homopolymerů při vysoké rozlišovací schopnosti a je snadno implementovatelná do běžných HPLC laboratoří.

Reference

V textu nebyly uvedeny explicitní literární citace.