Separation of a Mixture of Vitamin K Isomers Using a Solid Core HPLC Column at Sub-ambient Temperature

Význam tématu

Analytická separace vitamínu K je klíčová pro hodnocení jeho biologické aktivity a kvality potravinářských a farmaceutických produktů. Rozlišení strukturních izomerů vitamínu K1 je nezbytné pro přesné stanovení jejich obsahu a studie metabolismu. Vysoce účinné chromatografické metody se sub-ambientní kontrolou teploty umožňují zlepšení rozlišení a zkrácení doby analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout rychlou, vysoce výkonnou metodu pro separaci směsi vitamínu K2 a cis/trans izomerů vitamínu K1 na Accucore C30 kolóně za sub-ambientních teplot. Metoda má zajistit optimální rozlišení kritické dvojice izomerů a zároveň udržet nízké provozní tlaky kompatibilní s konvenčním HPLC vybavením.

Použitá metodika a instrumentace

Pracovní standardy vitamínu K1 a K2 byly připraveny v acetonitrilu při koncentraci 200 µg/ml. Analýza probíhala na systému Thermo Scientific Accela UHPLC s kolónou Accucore C30 (2,6 µm, 100×2,1 mm). Mobilní fáze byla isokratická (4 % voda : 96 % methanol). Teplota kolóny byla nastavena na 15 °C, objem injekce 2 µl (částečná křivka) a detekce probíhala UV při vlnové délce 250 nm. Pracovní rozpětí průtoku zahrnovalo 250–500 µl/min a zpětný tlak dosahoval až 295 bar při 500 µl/min.

Hlavní výsledky a diskuse

Vitamin K2 eluoval jako první, za ním následovaly trans a poté cis izomer vitamínu K1. Rozlišení izomerů výrazně závisí na teplotě kolóny, s optimem kolem 15 °C. Při teplotách nad 20 °C se izomery nesegmentují.

Účinek teploty na časy zadržení a rozlišení:

• 15 °C: nejvyšší rozlišení kritické dvojice
• 20–35 °C: postupné zhoršení separace

Vliv průtoku na rozlišení a tlak:

• 250 µl/min: rozlišení 2,01, tlak 163 bar
• 350 µl/min: rozlišení 1,78, tlak 221 bar
• 500 µl/min: rozlišení 1,49, tlak 295 bar

Metoda poskytuje bazální rozlišení i při vysokých průtocích a umožňuje analýzu pod 4 minuty při 500 µl/min.
Reprodukovatelnost (n=6) ukázala koeficient variační (CV) čtasu zadržení 0,1 % a rozlišení 0,2 %.

Přínosy a praktické využití metody

Aplikovaná metoda dovoluje rychlé a spolehlivé stanovení vitamínu K2 a izoform vitamínu K1 v potravinách, krmivech a farmaceutických přípravcích. Nízká teplota kolóny zlepšuje selektivitu, zatímco použití Core Enhanced Technology snižuje tlakové nároky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vylepšení mohou zahrnovat kombinaci s hmotnostní spektrometrií pro lepší citlivost a selektivitu, použití zelenějších mobilních fází nebo adaptaci na online vzorkování v potravinářském průmyslu. Výzkum v oblasti nových sorbentů a dynamické termostatizace rozšíří aplikační potenciál.

Závěr

Studie potvrdila, že Accucore C30 kolóna při 15 °C umožňuje vysoce efektivní separaci izomerů vitamínu K1 a homologů vitamínu K2 za krátkou dobu analýzy a nízkého tlaku. Metoda je reprodukovatelná a vhodná pro rutinní i výzkumné aplikace.

Reference

Application Note 20590, Thermo Fisher Scientific, Derek Hillbeck, 2012