Subunit Level Top-down ECD Characterization of Biotherapeutic Proteins: Improving Mass Spectral Clarity with Fragment Ion Level Ion Mobility
Postery | 2021 | Waters | ASMSInstrumentace
Charakterizace bioterapeutických proteinů na úrovni subjednotek je klíčová pro přesné určení struktury a post-translačních modifikací.
Elektronová zachycovací disociace (ECD) umožňuje získat komplementární data k běžným kolizně indukovaným metodám a zachovat labilní vedlejší řetězce.
Zařazení iontové mobility (IMS) na úrovni fragmentů výrazně zvyšuje jasnost hmotových spekter a rozšiřuje sekvenční krytí.
Cílem bylo otestovat a optimalizovat top-down ECD analýzu na cyklické IMS hmotnostní spektrometrii.
Modelovými vzorky byly bovinní karboanhydráza II a tři redukované/digestioné podjednotky NIST monoklonální protilátky (scFc, LC, Fd).
Studie porovnala tradiční CID, samotné ECD a kombinaci ECD s IMS ve stejném experimentálním uspořádání.
Pro kvalifikaci a optimalizaci ECD buňky byla infuze BCA (10 µM v 50:50 methanol:ddH₂O) při 10 µL/min.
Likvidní chromatografie (LC/MS) probíhala na ACQUITY UPLC Premier H-Class s BioResolve RP mAb Polyphenyl kolonu.
ECD buňka e-MSion byla instalována před sekcí iontové mobility na SELECT SERIES Cyclic IMS.
Datové zpracování využilo MassLynx 4.2, waters_connect (BayesSpray dekonvoluce) a ProSite Lite2 pro anotaci fragmentů.
U BCA (prekurzorový iont 25+, m/z=1162) samotné ECD generovalo velmi komplexní spektrum; zařazení IMS umožnilo výrazně lepší rozlišení fragmentů.
Srovnání sekvenčního krytí BCA: 11 % (CID), 76 % (ECD), 81 % (ECD-IMS), tj. o 154 více identifikovaných fragmentů.
Analýza podjednotek mAb po IdeS štěpení a redukci proběhla během 10 minut: scFc (3,98 min), LC (5,31 min), Fd (7,41 min).
Při cílených ECD experimentech dosáhla scFc subjednotka 52% sekvenčního krytí na analytické LC/MS úrovni.
Top-down ECD ve spojení s cyklickou iontovou mobilitou poskytuje výjimečné spektrální rozlišení a vysoké sekvenční krytí.
Metoda je efektivní jak při nanoflow infuzi, tak na analytické LC/MS míře, vhodná pro detaily strukturální charakterizace bioterapeutik.
Výsledky potvrzují potenciál adaptace této techniky do rutinních analytických workflow v biofarmaceutickém sektoru.
Iontová mobilita, LC/TOF, LC/HRMS, LC/MS, LC/MS/MS
ZaměřeníFarmaceutická analýza
VýrobceWaters
Souhrn
Význam tématu
Charakterizace bioterapeutických proteinů na úrovni subjednotek je klíčová pro přesné určení struktury a post-translačních modifikací.
Elektronová zachycovací disociace (ECD) umožňuje získat komplementární data k běžným kolizně indukovaným metodám a zachovat labilní vedlejší řetězce.
Zařazení iontové mobility (IMS) na úrovni fragmentů výrazně zvyšuje jasnost hmotových spekter a rozšiřuje sekvenční krytí.
Cíle a přehled studie
Cílem bylo otestovat a optimalizovat top-down ECD analýzu na cyklické IMS hmotnostní spektrometrii.
Modelovými vzorky byly bovinní karboanhydráza II a tři redukované/digestioné podjednotky NIST monoklonální protilátky (scFc, LC, Fd).
Studie porovnala tradiční CID, samotné ECD a kombinaci ECD s IMS ve stejném experimentálním uspořádání.
Použitá metodika a instrumentace
Pro kvalifikaci a optimalizaci ECD buňky byla infuze BCA (10 µM v 50:50 methanol:ddH₂O) při 10 µL/min.
Likvidní chromatografie (LC/MS) probíhala na ACQUITY UPLC Premier H-Class s BioResolve RP mAb Polyphenyl kolonu.
ECD buňka e-MSion byla instalována před sekcí iontové mobility na SELECT SERIES Cyclic IMS.
Datové zpracování využilo MassLynx 4.2, waters_connect (BayesSpray dekonvoluce) a ProSite Lite2 pro anotaci fragmentů.
Hlavní výsledky a diskuse
U BCA (prekurzorový iont 25+, m/z=1162) samotné ECD generovalo velmi komplexní spektrum; zařazení IMS umožnilo výrazně lepší rozlišení fragmentů.
Srovnání sekvenčního krytí BCA: 11 % (CID), 76 % (ECD), 81 % (ECD-IMS), tj. o 154 více identifikovaných fragmentů.
Analýza podjednotek mAb po IdeS štěpení a redukci proběhla během 10 minut: scFc (3,98 min), LC (5,31 min), Fd (7,41 min).
Při cílených ECD experimentech dosáhla scFc subjednotka 52% sekvenčního krytí na analytické LC/MS úrovni.
Přínosy a praktické využití metody
- Rychlá a spolehlivá top-down charakterizace proteinových subjednotek a jejich PTM.
- Zachování labilních modifikací díky jemné fragmentaci N–Cα vazeb.
- Implementace na rutinní LC/MS platformy pro QA/QC v biotechnologickém průmyslu.
Budoucí trendy a možnosti využití
- Širší aplikace ECD-IMS pro komplexní biologické matrice a nové bioterapeutické molekuly.
- Další vylepšení softwarových nástrojů pro automatizovanou dekonvoluci a anotaci velkých datasetů.
- Integrace s dalším rozšířením IMS kapacit pro vyšší rozlišení a rychlejší analýzu.
Závěr
Top-down ECD ve spojení s cyklickou iontovou mobilitou poskytuje výjimečné spektrální rozlišení a vysoké sekvenční krytí.
Metoda je efektivní jak při nanoflow infuzi, tak na analytické LC/MS míře, vhodná pro detaily strukturální charakterizace bioterapeutik.
Výsledky potvrzují potenciál adaptace této techniky do rutinních analytických workflow v biofarmaceutickém sektoru.
Reference
- Shion H., Williams B.J., Cooper-Shepherd D., Yu Y.Q. Subunit Level Top-down ECD Characterization of Biotherapeutic Proteins: Improving Mass Spectral Clarity with Fragment Ion Level Ion Mobility. Waters Corporation, 2021.
Obsah byl automaticky vytvořen z originálního PDF dokumentu pomocí AI a může obsahovat nepřesnosti.
Podobná PDF
EXPANDING NATIVE MASS SPECTROMETRY CAPABILITIES FOR SOLUBLE AND MEMBRANE PROTEINS USING A QUADRUPOLE-ION MOBILITY-TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETRY SYSTEM
2024|Waters|Postery
EXPANDING NATIVE MASS SPECTROMETRY CAPABILITIES FOR SOLUBLE AND MEMBRANE PROTEINS USING A QUADRUPOLE-ION MOBILITY-TIME-OF-FLIGHT MASS SPECTROMETRY SYSTEM Brad Williams1, Dale A. Cooper-Shepherd2, Mario Hensen3, Kleitos Sokratos3, Jonathan T.S. Hopper3, and James I. Langridge2 1. Waters Corporation, 34 Maple Drive, Milford,…
Klíčová slova
sid, sidims, imscyclic, cyclicmicelle, micellenative, nativemobility, mobilitymembrane, membraneactivation, activationselect, selectdetergent, detergentseries, seriesbrowsed, browsedautomated, automatedprotein, proteinenables
In-Depth Versatile Characterization of Aspartic Acid Isomers via a Cyclic Ion Mobility Mass Spectrometry (cIMS)
2021|Waters|Postery
In-Depth Versatile Characterization of Aspartic Acid Isomers via a Cyclic Ion Mobility Mass Spectrometry (cIMS) Samantha Ippoliti1; Brad J. Williams1, Dale Cooper-Shepherd2, Ying Qing Yu1, Weibin Chen1, Barbara Sullivan1, James I. Langridge2 1Waters Corporation, Milford, MA, USA; 2Waters Corporation, Wilmslow,…
Klíčová slova
asp, aspcims, cimsisoasp, isoaspmobility, mobilitytmab, tmabims, imscyclic, cyclicspecies, speciesvia, viahdms, hdmspeptides, peptidesaspartic, asparticion, ionbiotherapeutic, biotherapeutictryptic
Electron Capture Dissociation in Combination With High Performance Cyclic Ion Mobility Separation for Detailed Protein Studies
2024|Waters|Aplikace
Application Note Electron Capture Dissociation in Combination With High Performance Cyclic Ion Mobility Separation for Detailed Protein Studies Dale Cooper-Shepherd Waters Corporation This is an Application Brief and does not contain a detailed Experimental section. Abstract Electron capture dissociation (ECD)…
Klíčová slova
mobility, mobilitycyclic, cyclicdissociation, dissociationcapture, captureprotein, proteinelectron, electronstudies, studiesdetailed, detailedcombination, combinationseparation, separationecd, ecdion, ionions, ionsperformance, performancehigh
HIGHER SENSITIVITY, DATA QUALITY AND THROUGHPUT FOR HYDROGEN DEUTERIUM EXCHANGE EXPERIMENTS WITH EXTENDED ION MOBILITY SEPARATION
2021|Waters|Postery
HIGHER SENSITIVITY, DATA QUALITY AND THROUGHPUT FOR HYDROGEN DEUTERIUM EXCHANGE EXPERIMENTS WITH EXTENDED ION MOBILITY SEPARATION Alexandre F. Gomes[1], Lindsay Morrison[1], Malcolm Anderson[2], Colette Quinn[1] [1] Waters Corporation, 34 Maple St., Milford, MA, 01757, USA [2] Waters Corporation, Stamford Avenue,…
Klíčová slova
hdx, hdxcyclic, cyclicpeptides, peptidesdeuterium, deuteriumims, imssynapt, synaptpeptide, peptidepepsin, pepsincoverage, coveragephosb, phosbadc, adcexperiments, experimentssequence, sequenceleap, leapmobility
