LC-MS/MS Analysis of Edrophonium, Neostigmine, and Pyridostigmine in Plasma Using HILIC Chromatography and Weak Cation-Exchange SPE

Význam tématu

Analýza inhibitorů acetylcholinesterázy edrofonia, neostigminu a pyridostigminu v plazmě je klíčová pro klinický i biomedicínský výzkum. Tyto látky se používají při diagnostice a léčbě myasthenia gravis a dalších poruch svalové síly. Spolehlivá kvantifikace ve složitých biologických matricích podporuje jak terapeutický monitoring, tak vývoj nových léčivých postupů.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout rychlou, citlivou a reprodukovatelnou metodu LC-MS/MS pro kvantifikaci quaternárních aminů edrofonia, neostigminu a pyridostigminu v lidské plazmě. Studie využila kombinaci HILIC chromatografie a slabé kationtové výměnné SPE pro optimalizaci čistoty extraktů, snížení matrice a dosažení nízké mezní koncentrace (LLOQ 0,1 ng/mL).

Použitá metodika

Postup zahrnoval:

• Přípravu vzorků s 180 µL plazmy, přídavkem interního standardu a pufru (20 mM Na₂HPO₄, pH 8).
• Solid-phase extraction se SOLA WCX kartáčky: kondice, aplikace vzorku, praní pufrem a methanolem, eluce kyselým methanolem.
• Suché koncentrování a rekonstituci do acetonitrilu/ammonium formiátu (80:20, pH 3,3).
• Separaci na Syncronis HILIC 1,7 µm kolonce (100 × 2,1 mm) s mobilní fází acetonitril/ammonium formiát (90:10) při 0,5 mL/min a teplotě 25 °C.
• Detekci pomocí TSQ Vantage MS/MS v pozitivním režimu HESI, vyhodnocení přechodů MRM.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Dionex UltiMate 3000 RSLC
• Kolonka Syncronis HILIC 1,7 µm, 100 × 2,1 mm
• MS detektor Thermo Scientific TSQ Vantage s HESI ionizací
• SOLA WCX SPE kartáčky (10 mg, 1 mL)
• UltraVap koncentrátor, eVol robotický dispenser

Hlavní výsledky a diskuse

• Rozlišení a analýza všech tří látek a interního standardu za méně než 3 minuty.
• Lineární rozsahy 0,1–100 ng/mL s r² > 0,996 pro všechny analyty.
• Přesnost back-calculated hodnot v rozmezí ±9 % napříč standardy.
• Reprodukovatelnost (n=20)
  – %CV bez IS korekce < 7 %
  – %CV s IS korekcí < 6 %
• Obnovení extrakce 74,9–90,9 % a nízké matriční potlačení (< 8 %).
• Detekční citlivost LLOQ 0,1 ng/mL umožňuje kvantifikaci v trace úrovních.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká rychlost analýzy podporuje náročné klinické a biofarmaceutické laboratoře.
• Minimální spotřeba vzorku (180 µL) a organických rozpouštědel.
• Díky nízkým maticovým efektům a vysoké čistotě extraktů se snižují falešné výsledky a opakovanost měření.
• Metoda je vhodná pro terapeutický monitoring a farmakokinetické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s ultrarychlou UHPLC a high-resolution MS pro rozšíření spektra analyzovatelných látek.
• Automatizace přípravy vzorku pro zvýšení throughput v klinických laboratořích.
• Rozvoj multi-analyzových panelů zahrnujících další farmaka a metabolity.
• Využití v toxikologii a forenzních aplikacích pro rychlou detekci quaternárních aminů.

Závěr

Vyvinutá LC-MS/MS metoda s HILIC chromatografií a SOLA WCX SPE nabízí robustní, rychlé a citlivé řešení pro kvantifikaci edrofonia, neostigminu a pyridostigminu v plazmě. Dosahuje vynikajících parametrů přesnosti, preciznosti, obnovy i nízkých maticových efektů, což ji předurčuje pro klinickou a biofarmaceutickou praxi.