SPE, LC-MS/MS Method for the Determination of Ethinyl Estradiol from Human Plasma

Význam tématu

Ethinyl estradiol je klíčovou složkou hormonálních antikoncepčních přípravků. Jeho spolehlivá kvantifikace v lidské plasmě je zásadní pro farmakokinetické studie, klinické monitorování a zajištění kvality léčiv. Metody vysoké citlivosti a specificity umožňují detekovat nízké koncentrace v komplexních biologických matricích a podporují rozhodování ve výzkumu i praxi.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout jednoduchou, rychlou a vysoce citlivou LC-MS/MS metodu pro stanovení ethinyl estradiolu v lidské plasmě v rozsahu 5–200 pg/mL. Pro dosažení nízkého limitu kvantifikace byla uplatněna trojstupňová příprava vzorku kombinující extrakci SPE, derivatizaci a následné čištění SPE, následovaná chromatografickým rozdělením na C18 kolóně a detekcí na triple kvadrupólu.

Použitá metodika a instrumentace

Sample prep

• Extrahce: SOLA SCX SPE kartridž (10 mg/1 mL), reverzní fáze, kondicionování MeOH a voda, nástřik vzorku, dvoustupňové promývání a eluční fáze MeOH.
• Derivatizace: suspenze ve 100 mM NaHCO3 pH 10,5 a reakce s dansylchloridem při 60 °C, 30 min.
• Čištění po derivatizaci: opět SOLA SCX SPE se stejným postupem jako při extrakci.

Chromatografie

• Přístroj: Dionex UltiMate 3000 RSLC
• Kolona: Syncronis C18 50×2,1 mm, 1,7 µm
• Fáze A: voda + 0,1 % kyseliny formiové; fáze B: acetonitril; gradient 60→90 % B (0–5 min), návrat na 60 % B (5,2–6 min), průtok 0,5 mL/min, teplota 30 °C.
• Injekce: 10 µL.

MS/MS detekce

• Přístroj: Thermo Scientific TSQ Vantage se zdrojem H-ESI v kladné ionizaci
• Parametry: spray 3500 V, vaporizer 500 °C, capillary 375 °C, kolizní tlak 1,5 mTorr
• SRM: ethinyl estradiol-dansyl m/z 530,2→171,0; IS d4-derivát m/z 534,2→171,0.

Hlavní výsledky a diskuse

• Linearity: rozmezí 5–200 pg/mL, r2=0,997.
• Limit kvantifikace: 5 pg/mL.
• Přesnost (CV): 11,6 % na LOQ, ≤7,2 % při vyšších QC úrovních.
• Přesnost výsledků (%Diff): v rozsahu –8,9 % až 8,1 %.
• Recovery: 100–109 % napříč QC úrovněmi.
• Matrix interference: maximálně –12,4 %, obecně nízká.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a selektivita pro nízké koncentrace ethinyl estradiolu.
• Robustní a reprodukovatelný postup vhodný pro rutinní analýzy bio­analytických a klinických laboratoří.
• Snížení spotřeby vzorku a rozpouštědel díky efektivnímu SPE clean-up.
• Možnost vysokoprůtokového nasazení s nízkou chybovostí a optimalizovanými náklady.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace SPE-LC-MS/MS workflow pro vyšší průtok a konzistenci.
• Rozšíření metodiky na další steroidní hormony či metabolity.
• Integrace s vysokým rozlišením hmotnostní spektrometrie pro širší screening.
• Vývoj zelených analytických přístupů s minimalizací spotřeby organických rozpouštědel.

Závěr

Vyvinutá metoda umožňuje spolehlivou, rychlou a citlivou kvantifikaci ethinyl estradiolu v lidské plasmě při nízkých koncentracích. Splňuje požadavky bioanalytické validace a je vhodná pro aplikaci v klinickém výzkumu, farmakokinetice a kontrole kvality léčiv.

Reference

• FDA Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation.