SPE-LC-MS/MS Method for the Determination of Nicotine, Cotinine, and Trans-3-hydroxycotinine in Urine

Význam tématu

Analytická detekce nikotinu a jeho hlavních metabolitů kotininu a trans-3-hydroxykotininu v moči je klíčová pro studie expozice nikotinu, klinické a toxikologické aplikace. Rychlá, spolehlivá a citlivá metoda pomáhá monitorovat kouření, posuzovat biologickou dostupnost nikotinu a podporuje vyhodnocení farmakokinetiky v bioanalytickém výzkumu.

Cíle a přehled studie

Metoda kombinuje pevnou fázi SPE s následnou LC-MS/MS analýzou. Cílem je vyvinout robustní postup s minimem spotřeby vzorku a rozpouštědel, dosáhnout krátké doby analýzy (cyklus 3 minuty), vysoké reprodukovatelnosti, dobré liniarity a nízkých mezí stanovení (1–10 ng/mL).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky moči byly ošetřeny pomocí SOLA CX SPE kazet (10 mg/2 mL), po conditioning, aplikaci, dvou stupních promývání a eluci. Koncentrace eluantů se sušily pod dusíkem a rekonstituovaly v 200 µL vody/methanolu (70:30).

Použitá instrumentace

• LC systém: Thermo Scientific Accela 600 s injekcí 10 µL a tepelným blokem 30 °C
• Kolona: Syncronis C18 1.7 µm, 50 × 2.1 mm s předsloupcem
• Mobilní fáze A: voda + 0,1 % amoniaku; B: methanol + 0,1 % amoniaku; gradient 70:30 → 0:100 → 70:30 v časech 0–6 min
• MS detektor: Thermo Scientific TSQ Vantage s HESI ionizací, kladná polarita, spray 3500 V, vaporizer 400 °C
• Datové zpracování v LCQUAN v2.6

Hlavní výsledky a diskuse

Liniarita všech sloučenin byla potvrzena v rozmezí 1–1000 ng/mL (pro trans-3-hydroxykotinin 10–1000 ng/mL) s koeficientem determinace ≥ 0,9991. Meze kvantifikace byly 1 ng/mL pro nikotin a kotinin, 10 ng/mL pro hydroxykotinin. Přesnost (%RE) v QC bodech (15, 250, 600 ng/mL) se pohybovala v rámci ±20 % na LLOQ a ±15 % pro vyšší úrovně. Relativní standardní odchylky (%RSD) nebyly vyšší než 9,0 %. Průměrné výtěžnosti extrakce překročily 79,3 % pro všechny analyty.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlou manipulaci a nízkou spotřebu rozpouštědel
• Vysokou citlivost a nízké LOQ vhodné pro biomonitoring
• Vysokou reprodukovatelnost a stabilitu výsledků
• Krátký analytický cyklus (≤ 6 minut) umožňující vysokou propustnost vzorků

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikací pro multiplexní stanovení dalších metabolit nikotinu či xenobiotik v biologických matricích. Integrace s automatizovanými platformami a miniaturizace SPE kroků podpoří ještě vyšší propustnost a konzistenci výsledků. Kombinace s HRMS by mohla umožnit nedefinované screeningy a retrospektivní analýzy.

Závěr

Navržená SPE-LC-MS/MS metoda poskytuje rychlou, citlivou a validovanou kvantifikaci nikotinu, kotininu a trans-3-hydroxykotininu v moči. Díky minimální spotřebě vzorku a rozpouštědel a vynikajícím analytickým parametrem je vhodná pro klinické, toxikologické i výzkumné laboratoře.

Reference

Thermo Fisher Scientific Application Note 20709, 2013