Robust and reproducible peptide mapping and intact mass analysis workflows on a single instrument platform

Význam tématu

Peptidové mapování a analýza intaktní hmotnosti jsou klíčové pro charakterizaci bioterapeutických proteinů. Díky složitosti a variabilitě těchto molekul je nutné potvrdit správnou aminokyselinovou sekvenci, disulfidické vazby a přítomnost posttranslačních modifikací. Jedna jednotná platforma umožňuje zjednodušit workflow, zvýšit reprodukovatelnost a snížit pracovní náročnost laboratoří.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat využití jediné LC-MS platformy Thermo Scientific pro komplexní charakterizaci rekombinantního proteinu somatotropinu. Metoda zahrnuje automatizované trávení enzymem trypsin pomocí SMART Digest kitu, rychlou chromatografii a vysoce přesnou hmotnostní analýzu intaktního proteinu pod denaturačními i nativními podmínkami.

Použitá metodika a instrumentace

• UHPLC Vanquish Flex Quaternary se Sampler FT a diodovým detektorem
• Orbitrapový analyzátor Q Exactive HF BioPharma
• Kolony: Acclaim VANQUISH C18, MAbPac RP, Acclaim SEC-300
• Příprava vzorků: SMART Digest kit, redukce DTT, TCEP
• Software: BioPharma Finder 2.0, Chromeleon CDS

Hlavní výsledky a diskuse

• Kompletní peptidová sekvence somatotropinu potvrzena 100% pokrytím
• Správné disulfidické vazby identifikovány na nevyredukovaných vzorcích
• Detekce a kvantifikace posttranslačních modifikací (deamidace, oxidace, izomerizace) na úrovni jednotek procent
• Rychlý a reprodukovatelný enzymatický digest během 5–15 minut s minimem manuálních chyb
• Intaktní hmotnost proteinu pod denaturačními i nativními podmínkami odhalila monoisotopickou hmotnost s odchylkou <2 ppm

Přínosy a praktické využití metody

• Konsolidace více kontrolních atributů (sekvence, vazby, PTM) na jednom přístroji
• Úspora času – kompletní workflow do jedné hodiny
• Jednoduchá implementace do rutinního QA/QC bez hlubokých znalostí hmotnostní spektrometrie
• Možnost použití pouze MS signálu pro QC metodiku s přímou identifikací a kvantifikací

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow na další bioterapeutika a komplexní proteiny
• Integrace plně automatizovaných systémů přípravy vzorků
• Použití nativní MS pro studium vyšších struktur a komplexů proteinů
• Analytické metody založené na pokročilých algoritmech a umělé inteligenci pro rychlou interpretaci dat

Závěr

Jednotná LC-MS platforma ukázala vysokou robustnost, reprodukovatelnost a efektivitu pro peptidové mapování i analýzu intaktního proteinu. Výsledkem je plná sekvenční validace, přesná detekce vazeb a kvantifikace modifikací v jediném workflow, snadno použitelném v rutinních laboratořích.

Reference

1. Rogers RS et al. Development of a quantitative mass spectrometry multiattribute method for characterization of biologics, mAbs. 2015;7(5):881–890.
2. Ren D et al. An improved trypsin digestion method minimizes digestion-induced modifications. Anal Biochem. 2009;392:12–21.
3. Kollipara L, Zahedi RP. Protein carbamylation: in vivo modification or in vitro artefact? Proteomics. 2013;13:941–944.
4. Samonig M et al. SMART Digest compared to classic in-solution digestion of rituximab. Thermo Fisher Scientific Application Note 1159, 2016.
5. SMART Digest Kit Technical Guide. Thermo Fisher Scientific, 2015.
6. Samonig M, Scheffler K. LC/MS analysis of rituximab using Q Exactive. Thermo Fisher Scientific Application Note 591, 2013.